Genetic Diversity of genus Filopaludina in Mekong Basin Upper Northeastern Thailand Using PCR-RFLP and DNA Sequencing Techniques

Abstract

The objective of this study was to study the genetic diversity and Morphology of Pond snail genus Filopaludina in the Mekong River Basin of Thailand (Loei, Nong Khai, Bueng Kan, and Nakhon Phanom). The 262 specimens were collected from 28 locations. All specimen was classified by external morphology to two species three subspecies including F. martensi martensi, F. martensi cambodjensis and F. sumatrensis polygramma The Morphometrics were studied By measuring sizes of samples including, Shell length (sl), shell width (sw), last whorl hight (bc), apex to aperture height (ae), spire height (ah), aperture length ( ce) aperture width (fg), length from last surture to upper lip (de) found that apex to aperture height (ae) and aperture width (fg) have high classification coefficient at 0.938 and 0.411. While the lowest coefficient characteristic is the last whorl high (bc) at -2.264. The canonical discriminant shows clearly separation of F. m. cambodjensis and F. s. polygramma while F. m. cambodjensis is distributed within the group of F. m. martensi, showing a very close relationship. The genetic diversity of the sample was studied by PCR-RFLP and DNA sequencing. The COI gene was selected to primer for the genomic DNA of the Pond snail in size 710 bp. The two restriction enzymes: Dde I and Taq I were selected to digested PCR product. There are both 5 pattern of single haplotypes, respectively. The composite haplotypes were constructed from single haplotypes and showed 6 patterns without overlapping. The most frequency patterns were AB found in KMP1 and KMP4 (species F. m. martensi) as 30 percent. The mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1 (COI) DNA sequences were used to determine genetic variation. The phylogenetic tree classified genus Filopaludina into six evolutionary groups (A, B, C, D E and F), which is polyphyletic. The haplotype diversity was extremely distributed with 10 unique. The intraspecific divergence of F. m. martensi and F. m. cambodjensis shows the average was 0.1739 and 0.1203 respectively.

การศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมของหอยสกุล Filopaludina 2 ชนิด 3 ชนิดย่อย คือ F. martensi martensi, F. martensi cambodjensis และ F. sumatrensis polygramma ในพื้นที่ 4 จังหวัด ได้แก่ เลย หนองคาย บึงกาฬ และนครพนม บริเวณลุ่มแม่น้ำโขงของประเทศไทย จำนวน 28 จุด พบตัวอย่างทั้งหมด 262 ตัวอย่าง ศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยาภายนอกและวิเคราะห์ทางสัณฐานวิทยา โดยวัดขนาดความยาวเปลือก (sl), ความกว้างเปลือก (sw), ความสูงของวงสุดท้าย (bc), ความยาวจากยอดถึงช่องเปิดเปลือก (ae), ความสูงของวงเกลียว (ah), ความยาวช่องเปิดเปลือก (ce) ความกว้างช่องเปิดเปลือก (fg), ความยาวจากซูเจอร์สุดท้ายถึงปากเปลือกบน (de) พบว่าลักษณะ ae และ fg มีค่าสัมประสิทธิ์การจำแนกสูงที่ 0.938 และ 0.411 ส่วนลักษณะที่มีค่าสัมประสิทธิ์การจำแนกต่ำที่สุดคือ bc ซึ่งมีค่าอยู่ที่ -2.264 เมื่อจำแนกโดย canonical discriminant พบว่าหอยชนิด F. sumatrensis polygramma มีตำแหน่งการกระจายต่างจากชนิดอื่นอย่างชัดเจน ส่วนชนิด F. martensi cambodjensis และ F. martensi martensi มีตำแหน่งการกระจายที่ไม่แตกต่างกันแสดงถึงความใกล้ชิดกันเป็นอย่างมาก โดยหอยชนิดที่มีการกระจายมากที่สุด F. martensi martensi คิดเป็น 75.6 เปอร์เซ็นต์

จากนั้นศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมของหอยด้วยวิธี PCR-RFLP และ DNA sequencing โดยทำการสกัดดีเอ็นเอหอยด้วยไพรเมอร์ COI ได้ genomic DNA มีขนาดเท่ากับ 710 bp ทำการตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ 2 ชนิด คือ Dde I และ Taq I พบว่าได้ single haplotypes ทั้งหมด 5 รูปแบบทั้งคู่ นำ single haplotypes ที่ได้มาสร้างเป็น composite haplotypes ได้ 6 รูปแบบ ซึ่งไม่มีการทับซ้อนกันเลย โดยรูปแบบที่พบมากที่สุดคือ AB พบใน KMP1 และ KMP4 เป็นชนิด F. m. martensi ทั้งหมด คิดเป็นร้อยละ 30 และทำการหาลำดับเบสบนนิวคลีโอไทด์ของยีน COI ในหอยขมสกุล Filopaludina มาวิเคราะห์ความหลากหลายทางพันธุกรรมของหอย โดยสร้าง phylogenetic tree พบว่าหอยสกุล Filopaludina แบ่งเป็น ุ6 กลุ่ม (A, B, C, D, E และF) ซึ่งมีรูปแบบเป็น polyphyletic โดยความหลากหลายของ haplotype ที่พบมีรูปแบบการกระจาย 10 แบบ และเป็น haplotypes ที่ไม่ซ้ำกัน ระยะห่างทางพันธุกรรมภายใน F. martensi martensi และ F. martensi cambodjensis มีค่าเฉลี่ยเท่ากับ 0.1739 และ 0.1203 ตามลำดับ