Trematode infection and genetic diversity of some freshwater snails in family Bithyniidae

Abstract

Several freshwater snails act as important intermediate hosts of several medically and veterinary important parasites, such as Opisthorchis viverrini. Infections of the liver fluke O. viverrini lead to cholangiocarcinoma (CCA) development in human and animals. Thus understanding of population genetic and genetic structure, as well as trematode infection of snail host is important for prevention and control of parasites infection. In this study, 2,982 freshwater snails, the majority from the family Bithyniidae, from the north and central areas of Thailand were collected for cercarial shedding and crushing methods. The infection rate was 6.06% in Bihynia siamensis goniomphalos, 4.21% in B. s. siamensis, 0.47% in B. funiculata, and 5.57% in Hydrobioides nassa. The parasites commonly found in these snails were Echinostome and Xiphidio cercariae. Cytochrome c oxidase subunit I (COI) and 16S ribosomal DNA (16 rDNA) were used as molecular markers for molecular identification and exploring genetic variation of H. nassa and Bithynia species. COI sequences can be used to differentiate H. nassa from Bithynia, as well as between Bithynia species/subspecies, whereas 16S rDNA sequences were not able to differentiate subspecies of Bithynia. Haplotype network and AMOVA analyses revealed that H. nassa, B. s. siamensis, B. s. goniomphalos, and B. funiculata were classified into three, four, six, and three haplogroups, respectively. The genetic structures of H. nassa and Bithynia were sub-structured related to river basins in the north and central areas of Thailand. Surprisingly, the distributions of all three Bithynia species/subspecies were found in the north of Thailand. Moreover, several localities found co-existed between species/sub-species of Bithynia. The phylogenetic trees of COI and 16S rDNA reveal some specimens belonged to a cryptic group, which was unable to identify to subspecies and clustered between B. s. siamensis and B. s. goniomphalos. In addition, four intron regions of the Arginine kinase (AK) gene, namely intron1 to intron4 were characterized. Of these, intron2 region showed high variable nucleotides, including several positions of insertion/deletion (InDel), which can be potentially used for genetic variation study in Bithynia. However, it was not suitable to use for species/subspecies differentiation, as well as phylogenetic analyses of Bithynia. This study revealed that COI is the most potential genetic marker to identify and differentiate H. nassa and Bithynia spp., whereas 16S rDNA shows less polymorphism but effectively discriminates at genus and species level. The intron region shows highest polymorphism, which was not suitable for using as a diagnostic marker. Based on molecular analyses suggested that B. s. goniomphalos, B. s. siamensis, and H. nassa are “species complex”, and demonstrated complex of phenotypically similar but genetically distinct species.

หอยน้ำจืดหลายชนิดเป็นตัวกลางของพยาธิใบไม้ที่มีความสำคัญทางการแพทย์และสัตวแพทย์ ยกตัวอย่างเช่น พยาธิใบไม้ตับชนิด Opisthorchis viverrini การติดเชื้อพยาธิใบไม้ตับ O. viverrini ก่อให้เกิดมะเร็งท่อน้ำดีทั้งในคนและสัตว์ ดังนั้นความเข้าใจเกี่ยวกับพันธุศาสตร์ประชากรและโครงสร้างทางพันธุกรรม รวมถึงการติดเชื้อพยาธิใบไม้ชนิดต่างๆ ในหอยที่เป็นตัวกลางจึงเป็นข้อมูลสำคัญที่สามารถนำไปใช้ในการป้องกันและควบคุมการติดเชื้อพยาธิได้อย่างมีประสิทธิภาพ ในการศึกษาครั้งนี้ ทำการเก็บตัวอย่างหอยน้ำจืดทั้งหมด 2,982 ตัวอย่าง โดยศึกษาการติดเชื้อพยาธิใบไม้ด้วยวิธี shedding และ crushing ซึ่งตัวอย่างส่วนใหญ่เป็นหอยในวงศ์ Bithyniidae ที่เก็บรวบรวมจากภาคเหนือและภาคกลางของประเทศไทย พบอัตราการติดเชื้อพยาธิใบไม้ในหอย B. s. goniomphalos ร้อยละ 6.06, B. s. siamensis ร้อยละ 4.21, B. funiculata ร้อยละ 0.47 และ H. nassa ร้อยละ 5.57 พยาธิใบไม้ชนิดที่พบมากที่สุดได้แก่ Echinostome และ Xiphidio เมื่อนำเครื่องหมายโมเลกุล ชนิด cytochrome c oxidase subunit I (COI) และ 16S ribosomal DNA (16 rDNA) มาใช้ในการจำแนกชนิดและศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมของหอย H. nassa และ Bithynia พบว่ายีน COI สามารถใช้ในการจำแนกชนิดระหว่าง H. nassa กับ Bithynia ได้ รวมถึงสามารถจำแนกชนิด/ชนิดย่อยของหอยสกุล Bithynia ได้เช่นกัน ในขณะที่ 16S rDNA ไม่สามารถใช้จำแนกชนิดย่อยของหอยสกุล Bithynia ได้ เมื่อวิเคราะห์โครงสร้างทางพันธุกรรมด้วยการวิเคราะห์ haplotype network และ AMOVA สามารถจัดกลุ่มพันธุกรรมของ H. nassa, B. s. siamensis, B. s. goniomphalos และ B. funiculata ออกเป็น 3, 4, 6 และ 3 กลุ่ม haplotype (haplogroups) ตามลำดับ ซึ่งการจัดกลุ่มทางพันธุกรรมนี้ มีความสัมพันธ์กับพื้นที่ลุ่มแม่น้ำในภาคเหนือและภาคกลางของประเทศไทย นอกจากนี้ยังพบการกระจายร่วมกันระหว่างชนิดและชนิดย่อยของหอย Bithynia ในบางพื้นที่ที่ทำการศึกษาในครั้งนี้ จากการวิเคราะห์สายสัมพันธ์ทางวิวัฒนาการ โดยใช้เครื่องหมาย COI และ 16S rDNA พบกลุ่มตัวอย่างที่ถูกจัดเป็นชนิดคลุมเครือ (cryptic) ซึ่งไม่สามารถจำแนกได้ถึงชนิดย่อย และจัดกลุ่มพันธุกรรมอยู่ระหว่างชนิดย่อย B. s. siamensis และ B. s. goniomphalos ในการศึกษาครั้งนี้ ยังได้ทำการวิเคราะห์ส่วนของอินทรอน (intron) ของยีน Arginine kinase (AK) จำนวน 4 ตำแหน่ง ได้แก่ intron1 ถึง intron4 ผลการศึกษาพบว่า intron2 มีการแปรผันของลำดับนิวคลีโอไทด์สูง ทั้งยังพบส่วนของการขาดหาย/แทรกของลำดับเบส (InDel) ในบางตำแหน่ง ซึ่งสามารถใช้เป็นเครื่องหมายโมเลกุลในการศึกษาการแปรผันทางพันธุกรรมในสกุล Bithynia ได้เป็นอย่างดี แต่ไม่เหมาะสมในการใช้ระบุชนิด/ชนิดย่อย ของหอยสกุล Bithynia การศึกษาครั้งนี้แสดงให้เห็นว่ายีน COI เป็นเครื่องหมายที่มีประสิทธิภาพสูงสุดในการจำแนกชนิดของหอย H. nassa และ Bithynia ในขณะที่ 16S rDNA มีความแปรผันทางพันธุกรรมต่ำ แต่สามารถใช้จำแนกหอยได้ในระดับชนิดและสกุล จากการวิเคราะห์พันธุกรรมของหอยน้ำจืดในการศึกษาครั้งนี้ แสดงให้เห็นว่า หอยชนิด B. s. goniomphalos, B. s. siamensis และ H. nassa เป็นชนิดซับซ้อน (species complex) ที่มีลักษณะทางสัณฐานวิทยาคล้ายคลึงกัน แต่มีความแตกต่างในระดับพันธุกรรม