Development of Bacillus spp. bio-product using microencapsulation technique for control of Xanthomonas oryzae pv. oryzae, a causal agent of rice bacterial leaf blight

Abstract

Rice bacterial leaf blight caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) is a major problem that decreases the yield and quality of rice. The objectives of this research are (1) to search for antagonistic bacteria that inhibit the development of rice bacterial leaf blight disease and (2) to develop bio-products to control Xoo. Fifteen isolates of antagonist bacteria against Xoo were identified using an agar plate inhibition assay. Five of these isolates were able to inhibit Xoo. Isolate N1 appeared to be the most effective with an inhibition zone of 1.73±0.15 cm, which is statistically significantly larger than the inhibition zones of other isolates in this study. The efficacy of isolate N1 against Xoo was tested by paper disc diffusion method, showing that had the highest inhibition ability with an inhibition zone of 4.76±1.53 cm, which was significantly larger than that of the control. Morphological and 16S rRNA sequence data indicated that the antagonist bacteria of isolate N1 are closely related to Bacillus velezensis and are resistant to (1) the pesticides Amigo, Beam 75WP, Greendive 500EC, Omycin and Thibac; (2) the herbicides Clorac and Levin Fand; and (3) the insecticides Provado, but not Paraquat. The best inhibition of rice bacterial leaf blight was obtained with fresh isolate N1 cells, yielding a disease reduction index of 65.08%.

In order to find the most optimal culture medium for the growth and endospore production of isolate N1 bacteria, four modified nutrient broth media in shake flasks were compared, each with different sucrose concentrations ranging from 10 to 40 g/L. The results showed that after 96 hours of incubation, the modified nutrient broth culture medium containing 20 g/L of sucrose had a maximum dry cell weight of 2.36 g/L, a maximum cell production of 1.32x109 CFU/mL, and a maximum endospore production of 3.09x106 spore/mL. Therefore, this modified nutrient broth medium with 20 g/L sucrose was selected to cultivate isolate N1 for the development of bio-products.

For the further development of isolate N1 for bio-products, three different formulae were tested using microencapsulation technique through a spray drying process. This showed that formula 3 (10% skim milk, 20% maltodextrin, 0.06% sodium alginate, and 5% tapioca starch) yielded the highest antagonistic bacterial viability after spray drying of 1.24 x 107 CFU/g with decreased of 1.68 Log CFU/g. After storage at room temperature for three months it appeared that formula 2 (10% skim milk, 20% maltodextrin, 0.06% sodium alginate, and 5% corn starch) showed the highest survival of antagonistic bacteria with 1.44 x 106 CFU/g with decreased of 0.61 Log CFU/g.The morphological characteristic of the isolate N1 bacteria in the bio-product were studied by scanning electron microscopy. This revealed that in the three formulae, the antagonistic bacteria had a spherical shape with both smooth and wrinkled surfaces.

Among the three formulae of isolate N1 bacteria against Xoo, formula 2 was able to control rice bacterial leaf blight disease with the highest disease reduction index (45.87%). In conclusion, this research shows that antagonistic bacteria can be effective against rice bacterial leaf blight disease and can be used to develop bio-products for disease control. As such, this opens the possibility for agriculturists to control the quantity and quality of their rice production in an environmental-friendly condition.

โรคขอบใบแห้งของข้าวที่มีสาเหตุมาจากเชื้อแบคทีเรีย Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) เป็นโรคที่สำคัญและส่งผลกระทบต่อผลผลิตและคุณภาพของข้าว งานวิจัยนี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อคัดเลือกแบคทีเรียปฏิปักษ์ที่มีประสิทธิภาพในการยับยั้งเชื้อสาเหตุโรคขอบใบแห้งของข้าวและนำไปพัฒนาชีวภัณฑ์ จากการคัดเลือกแบคทีเรียปฏิปักษ์ 15 ไอโซเลต ในการยับยั้งเชื้อ Xoo ด้วยวิธี agar plate inhibition assay พบว่ามีแบคทีเรียปฏิปักษ์ จำนวน 5 ไอโซเลต ที่สามารถยับยั้งเชื้อ Xoo ได้ โดยแบคทีเรียปฏิปักษ์ไอโซเลต N1 มีความสามารถยับยั้งเชื้อสาเหตุโรคได้สูงสุด มีความกว้างของบริเวณยับยั้งเท่ากับ 1.73±0.15 เซนติเมตร แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติกับแบคทีเรียปฏิปักษ์ไอโซเลตอื่น ๆ จึงนำมาทดสอบประสิทธิภาพของในการยับยั้งเชื้อ Xoo ด้วยวิธี paper disc diffusion พบว่าแบคทีเรียปฏิปักษ์ ไอโซเลต N1 มีความสามารถในการยับยั้งเชื้อสาเหตุโรคสูงสุด มีเส้นผ่าศูนย์กลางบริเวณยับยั้งเท่ากับ 4.76±1.53 เซนติเมตร แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติเมื่อเปรียบเทียบกับกรรมวิธีควบคุม เมื่อจำแนกชนิดของแบคทีเรียปฏิปักษ์ไอโซเลต N1 ด้วยการศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยาและตรวจสอบด้วยเทคนิคทางชีวโมเลกุลโดยการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์บริเวณ 16s rRNA พบว่ามีความใกล้เคียงกับแบคทีเรีย Bacillus velezensis โดยแบคทีเรียปฏิปักษ์ไอโซเลต N1 สามารถทนต่อสารเคมีทางการเกษตรประเภทกลุ่มกำจัดโรคพืช ได้แก่ อะมิโก้ (amigo) บีม75WP (beam WP75) กรีนไดฟ์ 500EC (greendive 500EC) โอมัยซิน (omycin) และไทแบค (thibac) กลุ่มกำจัดวัชพืช ได้แก่ คลอแรค (clorac) เลวินเอฟ (levin F) กลุ่มกำจัดแมลง ได้แก่ โปรวาโด (provado) ยกเว้นสารเคมีกำจัดวัชพืชพาราควอต (paraquat) การทดสอบประสิทธิภาพของแบคทีเรียปฏิปักษ์ไอโซเลต N1 รูปแบบเชื้อสดในการยับยั้งเชื้อ Xoo ในพืชทดสอบ พบว่าแบคทีเรียปฏิปักษ์ไอโซเลต N1 สามารถยับยั้งเชื้อสาเหตุโรคขอบใบแห้งของข้าวได้ดีที่สุด มีดัชนีการยับยั้งโรคสูงสุดเท่ากับ 65.08 เปอร์เซ็นต์

การศึกษาอาหารเลี้ยงเชื้อที่เหมาะสมต่อการเจริญและการสร้างเอนโดสปอร์ของแบคทีเรียปฏิปักษ์ไอโซเลต N1 โดยเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ modified nutrient broth 4 สูตร ภายใต้สภาวะเขย่า ซึ่งอาหารเลี้ยงเชื้อแต่ละสูตรจะมีความเข้มข้นของซูโครสแตกต่างกัน คือ 10, 20, 30 และ 40 กรัมต่อลิตร พบว่าอาหารเลี้ยงเชื้อ modified nutrient broth สูตรที่ 2 ที่มีองค์ประกอบของซูโครส 20 กรัมต่อลิตร มีน้ำหนักเซลล์แห้งสูงสุดเท่ากับ 2.36 กรัมต่อลิตร มีจำนวนเซลล์และเอนโดสปอร์สูงสุดเท่ากับ 1.32 x 109 CFU/มิลลิลิตร และ 3.09 x 106 สปอร์ต่อมิลลิลิตร ตามลำดับ หลังจากเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 96 ชั่วโมง จึงพิจารณาเลือกอาหารเลี้ยงเชื้อ modified nutrient broth + ซูโครส 20 กรัมต่อลิตร ในการเพาะเลี้ยงแบคทีเรียปฏิปักษ์ไอโซเลต N1 เพื่อพัฒนาชีวภัณฑ์

การพัฒนาชีวภัณฑ์แบคทีเรียปฏิปักษ์ Bacillus spp.ไอโซเลต N1 ด้วยเทคนิคไมโครเอนแคปซูเลชั่น ผ่านกระบวนการทำแห้งแบบพ่นฝอย จำนวน 3 สูตร พบว่าชีวภัณฑ์แบคทีเรียปฏิปักษ์สูตรที่ 3 (skim milk 10 เปอร์เซ็นต์, maltodextrin 20 เปอร์เซ็นต์, sodium alginate 0.06 เปอร์เซ็นต์ และแป้งมันสำปะหลัง 5 เปอร์เซ็นต์) มีความมีชีวิตรอดของแบคทีเรียปฏิปักษ์หลังจากผ่านกระบวนการทำแห้งแบบพ่นฝอยสูงสุดเท่ากับ 1.24 x 107 CFU/กรัม ซึ่งมีจำนวนแบคทีเรียปฏิปักษ์ลดลง 1.68 Log CFU/กรัม หลังจากเก็บรักษาชีวภัณฑ์แบคทีเรียปฏิปักษ์ที่อุณหภูมิห้อง เป็นเวลา 3 เดือน พบว่าชีวภัณฑ์แบคทีเรียปฏิปักษ์ สูตรที่ 2 (skim milk 10 เปอร์เซ็นต์, maltodextrin 20 เปอร์เซ็นต์, sodium alginate 0.06 เปอร์เซ็นต์ และแป้งข้าวโพด 5 เปอร์เซ็นต์) มีจำนวนความมีชีวิตรอดของแบคทีเรียปฏิปักษ์สูงสุดเท่ากับ 1.44 x 106 CFU/กรัม ซึ่งมีจำนวนแบคทีเรียปฏิปักษ์ลดลง 0.61 Log CFU/กรัม การศึกษาลักษณะอนุภาคของชีวภัณฑ์ทั้ง 3 สูตร ภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด พบว่าอนุภาคของชีวภัณฑ์มีลักษณะกลมมีทั้งแบบผิวเรียบและเหี่ยวย่นผิวขรุขระ

เมื่อนำชีวภัณฑ์แบคทีเรียปฏิปักษ์ไอโซเลต N1 มาทดสอบประสิทธิภาพการยับยั้งเชื้อ Xoo ในพืชทดสอบ พบว่าชีวภัณฑ์สูตรที่ 2 สามารถควบคุมโรคขอบใบแห้งของข้าวได้ดี โดยมีดัชนีการยับยั้งโรคสูงสุดเท่ากับ 45.87 เปอร์เซ็นต์ จากงานวิจัยแสดงให้เห็นว่าแบคทีเรียปฏิปักษ์ที่มีประสิทธิภาพในการยับยั้งโรคขอบใบแห้งของข้าวสามารถนำมาพัฒนาชีวภัณฑ์ใช้ในการควบคุมโรคได้ ซึ่งเป็นทางเลือกให้กับเกษตรกรในการควบคุมคุณภาพของผลผลิตทางการเกษตรและเป็นมิตรต่อสิ่งแวดล้อมได้