Morphological, Antibacterial Properties and Development of Molecular Marker for Identification of Ophiocordyceps sobolifera (Hill ex Watson) G.H. Sung, J.M. Sung, Hywel-Jones & Spatafora (Ophiocordycipitaceae)

Abstract

Ophiocordyceps sobolifera is an entomopathogenic fungus that infected of dead cicada nymphs has been found from various location in Thailand, however, the available information on bioactivities in medical and agricultural benefits are limited. Therefore, the objective of this study was to study on its morphological characters, to evaluate of antibacterial activity and to development of molecular marker for identification of O. sobolifera. In this study, forty-two isolates of an entomopathogenic fungus were isolated and identified as O. sobolifera based on ITS gene sequencing. The morphological observation found that the fungus O. sobolifera has pink-brownish, cylindrical and subglobose shape of stroma that grows arising from head regions of insect host. Perithecia has oval-shaped and completely immersed in stroma. Ascus has long cylindrical shape with a unitunicate wall, hyaline and found ascus cap at tip. Conidia has long eliliosoidal approximately 1.5-2 x 2-4 μm in size. The colony characteristics on potato dextrose agar (PDA) were extremely slow-growing, colonies white to pink at beginning and becoming brown-black with spore mass. The antibacterial activity of this fungus was investigated by agar well diffusion method. The results showed that mycelial extract and crude protein extracted from 16 isolates of O. sobolifera had good inhibitory effect against Gram-positive bacteria including Bacillus cereus and both of methicillin resistant-and susceptible Staphylococcus aureus. Among them, the isolate Cod-NB1302 had the highest inhibitory effect. The protein pattern of these isolates were also determined using SDS-PAGE. The different protein patterns were observed between the active and non-active strains. The extra-protein band approximately size at 30 kDa was observed in the active strains. Therefore, the 30 kDa protein band of the isolate Cod-NB1302 was chosen for protein identification by amino acid sequencing. Based on the novel amino acid sequence performed, it was identified as superoxide dismutase -1 (SOD1). In addition, the molecular marker for identification of the fungus O. sobolifera was also developed by RAPD method. The results showed that the OPT13 random primer able to generate different DNA fingerprints of O. sobolifera, compared with other fungal strains that also isolated from cicada nymphs. A 153 bp (lower band) and 373 bp (upper band) bands that dominated in DNA fingerprinting of O. sobolifera were used for development of the specific primer by RAPD-SCAR primer. Four specific primers were designed; however, only SpsoL_f01/SpsoL_r01 primer could generate the target amplicon of O. sobolifera approximately size at 118 bp without non-specific bands after applied to other tested species. Moreover, this primer showed high sensitivity to detect the genomic DNA of O. sobolifera at lowest concentration as 5.84 pg and able to apply in all tests strains of O. sobolifera.

Ophiocordyceps sobolifera (O. sobolifera) จัดเป็นเชื้อราแมลงที่เข้าทำลายตัวอ่อนจักจั่นที่สามารถพบได้ในหลายพื้นที่ของประเทศไทย แต่ยังมีข้อมูลในการศึกษาการใช้ประโยชน์ของเชื้อราชนิดดังกล่าวเพื่อประโยชน์ทางการแพทย์และการเกษตรในวงจำกัด ดังนั้นการศึกษาครั้งนี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาสัณฐานวิทยา ศึกษาคุณสมบัติการยับยั้งเชื้อแบคทีเรีย และพัฒนาเครื่องหมายโมเลกุลสำหรับระบุชนิดเชื้อรา O. sobolifera โดยในการทดลองได้คัดแยกเชื้อราจากตัวอ่อนจักจั่นและระบุชนิดเป็นเชื้อรา O. sobolifera จำนวน 42 ไอโซเลท โดยการใช้ข้อมูลจากการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน ITS เมื่อศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยาพบว่า เชื้อรา O. sobolifera มีสโตรมาสีน้ำตาลอมชมพู รูปร่างทรงกระบองยาว (cylindric) ส่วนปลายพองออกเป็นกระเปาะรูปร่างค่อนข้างกลม (subglobose) โผล่งอกออกมาจากส่วนหัวของโฮสต์ เพอริทีเชียมีรูปไข่หรือคล้ายหยดน้ำ ฝังตัวอยู่ภายในสโตรมาทั้งหมด (immersed perithecia) ถุงหุ้มสปอร์ (ascus) รูปร่างทรงกระบอกยาว ใสไม่มีสี มีผนังชั้นเดียว (unitunicate) ส่วนปลายของถุงหุ้มสปอร์พบช่องเปิด (asci apex หรือ asci cap) พบโคนิเดียรูปร่างรีคล้ายเม็ดข้าวสาร ขนาดประมาณ 1.5-2 x 2-4 ไมโครเมตร และเมื่อศึกษาลักษณะของโคโลนีบนอาหารสังเคราะห์ พบว่า โคโลนีของเชื้อราที่เจริญบนอาหารเลี้ยงเชื้อ potato dextrose agar (PDA) มีการเจริญช้า โคโลนีสีชมพู-ขาว อัดแน่นคล้ายกำมะหยี่ เมื่อแก่พบการสร้าง spore mass สีน้ำตาลเข้มบริเวณกึ่งกลางโคโลนี เมื่อทำการศึกษาฤทธิ์การยับยั้งเชื้อแบคทีเรียด้วยวิธี agar well diffusion พบว่า สารสกัดเส้นใยและสารสกัดโปรตีนจากเชื้อรา O. sobolifera จำนวน 16 ไอโซเลท สามารถยับยั้งเชื้อแบคทีเรียได้ดีที่สุด โดยเฉพาะแบคทีเรียในกลุ่มแกรมบวก (gram positive bacteria) ได้แก่ Staphylococcus aureus ทั้งสายพันธุ์ที่ไวและดื้อต่อยาเมธิซิลิน รวมทั้งแบคทีเรีย Bacillus cereus อย่างไรก็ตามพบว่า ไอโซเลทที่ให้ผลการยับยั้งดีที่สุดคือ เชื้อรา O. sobolifera ไอโซเลท Cod-NB1302 และเมื่อนำโปรตีนจากเชื้อรา O. sobolifera มาวิเคราะห์ด้วยวิธี SDS-PAGE พบความแตกต่างแถบโปรตีนของเชื้อรา O. sobolifera ในกลุ่มที่มีฤทธิ์ยับยั้งและไม่ยับยั้งเชื้อแบคทีเรีย โดยพบแถบโปรตีนขนาด 30 kDa เฉพาะในกลุ่มเชื้อที่มีฤทธิ์ยับยั้งเชื้อแบคทีเรีย จึงได้นำแถบโปรตีนดังกล่าวจากเชื้อรา O. sobolifera ไอโซเลท Cod-NB1302 มาระบุชนิดและวิเคราะห์หาลำดับกรดอะมิโน พบว่า ลำดับกรดอะมิโนที่ได้มีความคล้ายคลึงกับเอนไซม์ superoxide dismutase -1 (SOD1) และเมื่อทำการออกแบบเครื่องหมายโมเลกุลในการระบุชนิดของเชื้อรา O. sobolifera ด้วยวิธี RAPD พบว่า ไพรเมอร์ OPT13 สามารถสร้างลายพิมพ์ดีเอ็นเอที่มีความแตกต่างระหว่างเชื้อรา O. sobolifera และเชื้อราชนิดอื่นๆ ที่คัดแยกได้จากตัวอ่อนจักจั่น จากนั้นทำการคัดเลือกแถบดีเอ็นเอที่มีความแตกต่างดังกล่าวจำนวน 2 ขนาด คือ แถบดีเอ็นเอขนาด 153 bp (lower band) และแถบดีเอ็นเอขนาด 373 bp (upper band) สำหรับนำมาออกแบบพัฒนาเครื่องหมายพันธุกรรมชนิด RAPD-SCAR primer ผลการศึกษาพบว่า สามารถออกแบบไพรเมอร์ได้จำนวน 4 คู่ แต่มีไพร์เมอร์ SpsoL_f01 และ SpsoL_r01 เพียงคู่เดียวที่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอของเชื้อรา O. sobolifera ได้อย่างจำเพาะและไม่เกิดปฏิกิริยาข้ามกับเชื้อราชนิดอื่นๆ และเมื่อนำมาทดสอบความไวในการตรวจหาเชื้อรา O. sobolifera พบว่า ปริมาณดีเอ็นเอที่น้อยที่สุดที่สามารถตรวจพบได้มีค่าเท่ากับ 5.84 พิโคกรัม และยังพบว่าไพรเมอร์ที่ออกแบบขึ้นสามารถนำไปประยุกต์ใช้กับเชื้อรา O. sobolifera ได้ทุกตัวอย่างที่นำมาทดสอบ