Biological Activity of Crude Extracts from Halophytes Azima sarmentosa, Maytenus mekongensis and Pluchea indica

Abstract

Land use in agriculture in the Northeastern Thailand is still faced with the problem of soil salinity, which is an important problem to the farmers. The soil in this area affect plant growth and result in low agricultural productivity and become to be an empty area with no vegetation. However, there are some plants that can grow in saline soil with different ability to tolerate salt. Soil conditions may promote plants in this area to contain important substances with interesting properties for medicinal uses. Medicinal plants have been interested and are important in the pharmaceutical industry and the household, which is present in several studies. Therefore, the researcher is interested in studying the halophytes that may have properties and contain important substances that can be developed into herbal recipes in the future. Three types of the halophytes were studied: Azima sarmentosa (Blume) Benth. & Hook. f., Maytenus mekongensis and Pluchea indica. Plant samples were collected and plant parts were separated into parts and extracted with 70% ethanol by reflux extraction. The crude extract was then studied using the phytochemical properties of total phenolic content (TPC) and total flavonoid content (TFC), properties of an antioxidant by DPPH and ABTS methods, antimicrobial properties by agar disc diffusion and MIC / MBC methods, evaluate the toxicity of the crude extract of red blood cells by hemolysis assay, assessment of the toxicity of a crude extract on human lymphocytes by MTT assay, analysis of the activity of crude extracts on phagocytosis process, and the tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) gene expression of macrophage cells was analyzed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) method. The study found that the crude extracts from all 3 types of plants had the highest % yield in leaf extraction when compared to other parts of the plant, the leaves of Maytenus mekongensis has a higher % yield than the other 2 plants. The high phenolic and flavonoid contents were found in the leaves extracts of Azima sarmentosa and Pluchea indica and root extract of Maytenus mekongensis. The study of antioxidant activity, it was found that flowers of Pluchea indica has the most anti-oxidation activity similar to the ascorbic acid. In addition, total phenolic content and total flavonoid content were significantly positve correlated with antioxidant activity in DPPH method, at very strong level for Maytenus mekongensis and strong level for Pluchea indica. Crude extracts of 3 halophytes were non-toxic to white blood cell (WBCs), monocytes (CD14+), non-monocytes (CD14-) and red blood cells at a concentration of 0-512 ug/ml. Crude extracts of 3 halophytes stimulated the macrophage phagocytic activity and killing activity to Staphylococcus aureus (MRSA) DMST 20654, followed by Staphylococcus aureus DMST 8840 at concentrations of 5, 50 and 500 ug/ml. The leaves extract of Azima sarmentosa at 5 ug/ml and stem extract of Azima sarmentosa at 5, 50 and 500 ug/ml stimulate the macrophage phagocytic activity and killing activity to Salmonella Typhimurium TISTR 2511, while Maytenus mekongensis, Pluchea indica and root extract of Azima sarmentosa stimulating macrophage phagocytic activity in 2 h greater than the 1 h to Escherichia coli ATCC 25922 and S. Typhimurium TISTR 2511. Crude extracts from 11 fractions of the saline soil plants were able to stimulate TNF-alpha expression in all three selected concentrations. The crude extracts of the root and stem of หนามพุงดอ, flower and bark of Pluchea indica, stimulate TNF-alpha expression in dose-dependent manners. In the other hand, it was found that the crude extract from the leaf of Pluchea indica was found to the reduction of TNF-alpha mRNA expression in the high concentration (500 ug/mL) was reduced at the level 1X PBS + hydrogen peroxide (H2O2). This research shows that the stems and leaves of Azima sarmentosa and Maytenus mekongensis, flowers and leaves of Pluchea indica might be used to stimulate the activity of macrophages for the treatment of various diseases including, immunocompromised host with immune suppression or the filaria infection. In contrast, the leaves of Pluchea indica might be used for wound healing and anti-inflammation such as rheumatoid arthritis and cardiovascular disease. This study may lead to increasing the value of unused plants in saline area and the farmer income. However, further studies of the compounds mechanism are still needed.

ดินที่ใช้ในการเกษตรในภาคตะวันออกเฉียงเหนือของประเทศไทยยังคงประสบกับปัญหาดินเค็ม ซึ่งเป็นอีกปัญหาหนึ่งที่มีความสำคัญต่ออาชีพเกษตรกร เนื่องจากดินในบริเวณพื้นที่ดินเค็มส่งผลต่อการเจริญเติบโตของพืช และส่งผลให้มีผลผลิตทางการเกษตรต่ำและกลายเป็นพื้นที่ว่างเปล่า ไม่มีพืชเจริญ อย่างไรก็ตามพบว่ามีพืชบางชนิดที่สามารถเจริญเติบโตได้ในพื้นที่ดินเค็มได้ โดยพืชแต่ละชนิดจะมีความสามารถในการทนเค็มได้แตกต่างกัน ซึ่งภาวะดินเค็มอาจส่งเสริมให้พืชในบริเวณนี้มีสารสำคัญ ที่มีคุณสมบัติน่าสนใจในการนำไปใช้ประโยชน์ในด้านสมุนไพรได้ พืชสมุนไพรจึงได้รับความสนใจ และมีความสำคัญในด้านอุตสาหกรรมยาและการใช้ในครัวเรือน ปัจจุบันจึงมีการศึกษาสมุนไพรทางการแพทย์เป็นจำนวนมาก ดังนั้นผู้วิจัยจึงสนใจศึกษาพืชชอบเค็มที่อาจมีคุณสมบัติและมีสารสำคัญที่สามารถนำไปพัฒนาเป็นตำรับสมุนไพรในอนาคต ซึ่งได้ทำการศึกษาพืชชอบเค็ม 3 ชนิด ได้แก่ หนามพุงดอ หนามแดง และขลู่ โดยทำการเก็บตัวอย่างพืชและแยกส่วนของพืชออกเป็นส่วนต่าง ๆ และสกัดด้วยตัวทำละลาย คือ 70% เอทานอล โดยวิธีการสกัดแบบรีฟลักซ์ จากนั้นนำสารสกัดหยาบไปศึกษาคุณสมบัติทางเคมีเบื้องต้นด้วยวิธี total phenolic content (TPC) และ total flavonoid content (TFC) คุณสมบัติการเป็นสารต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH และ ABTS คุณสมบัติการเป็นสารต้านจุลินทรีย์ด้วยวิธี agar disc diffusion และหาความเข้มข้นต่ำสุดที่สามารถยับยั้งเชื้อแบคทีเรีย (Minimum inhibitory concentration; MIC) และการทดสอบการทดสอบหาความเข้มข้นต่ำสุดที่สามารถฆ่าเชื้อแบคทีเรีย (Minimum bactericidal concentration; MBC) ประเมินความเป็นพิษของสารสกัดหยาบต่อเซลล์เม็ดเลือดแดงด้วยวิธี hemolysis assay ประเมินความเป็นพิษของสารสกัดหยาบต่อเซลล์เม็ดเลือดขาวมนุษย์ด้วยวิธี MTT assay วิเคราะห์ฤทธิ์สารสกัดหยาบต่อกระบวนการกลืนกินของเซลล์ (phagocytosis) และวิเคราะห์การแสดงออกของยีน tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) ของเซลล์แมโครฟาจด้วยวิธี reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) จากงานวิจัยนี้พบว่าในการสกัดสารสกัดหยาบจากพืชทั้ง 3 ชนิดมี %yield ในส่วนสกัดใบสูงที่สุด เมื่อเปรียบเทียบกับส่วนต่าง ๆ ของพืช โดยหนามแดงจะมี %yield ของใบสูงกว่าพืชอีก 2 ชนิด พบปริมาณสารประกอบฟีนอลและสารประกอบฟลาโวนอยด์ทั้งหมดมากที่สุดในสารสกัดส่วนใบสำหรับหนามพุงดอและขลู่ ขณะที่หนามแดงพบมากในส่วนราก ในการศึกษาฤทธิ์การต้านอนุมูลอิสระพบว่าดอกขลู่มีฤทธิ์การต้านออกซิเดชันมากที่สุดโดยมีฤทธิ์ใกล้เคียงกับ ascorbic acid นอกจากนี้ปริมาณสารประกอบฟีนอลและฟลาโวนอยด์ทั้งหมดมีความสัมพันธ์กับฤทธิ์การต้านอนุมูลอิสระในวิธี DPPH อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติในระดับสูงมากสำหรับหนามแดงและระดับสูงในขลู่ สารสกัดหยาบพืชชอบเค็มทั้ง 3 ชนิด ที่ความเข้มข้น 0-512 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ไม่มีความเป็นพิษต่อเซลล์เม็ดเลือดขาว เซลล์กลุ่มโมโนไซต์ และเซลล์กลุ่มไม่ใช่โมโนไซต์ รวมถึงเซลล์เม็ดเลือดแดง สารสกัดหยาบชอบเค็มทั้ง 3 ชนิด ที่ความเข้มข้น 5 50 และ 500 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร กระตุ้นให้เซลล์จับกินและทำลาย Staphylococcus aureus (MRSA) DMST 20654 ได้ดีที่สุดตามด้วย Staphylococcus aureus DMST 8840 สารสกัดหยาบหนามพุงดอส่วนใบที่ความเข้มข้น 5 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร และหนามพุงดอส่วนลำต้น ที่ความเข้มข้น 5 50 และ 500 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร กระตุ้นให้เซลล์จับกินและทำลาย Salmonella Typhimurium TISTR 2511 ในขณะที่สารสกัดหยาบหนามพุงดอส่วนราก หนามแดง และขลู่ กระตุ้นให้มีการจับกิน Escherichia coli ATCC 25922 และ S. Typhimurium TISTR 2511 ในชั่วโมงที่ 2 มากกว่าชั่วโมงที่ 1 สารสกัดหยาบจากพืชชอบเค็มทั้ง 11 ส่วน สามารถกระตุ้นการแสดงออกของ TNF-alpha ได้ ในทั้ง 3 ความเข้มข้นที่เลือก โดยสารสกัดหยาบส่วนรากและลำต้นหนามพุงดอ ลำต้นและใบหนามแดง ดอกและเปลือกนอกของขลู่ กระตุ้นการแสดงออกของ TNF-alpha สูงขึ้นเมื่อความเข้มข้นของสารสูงขึ้น ในขณะเดียวกัน พบว่า สารสกัดหยาบส่วนใบขลู่ลดแสดงออกของ TNF-alpha เมื่อความเข้มข้นของสารเพิ่มขึ้น โดยที่ความเข้มข้น 500 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ลดลงในระดับ 1X PBS+hydrogen peroxide (H2O2) จากการวิจัยนี้แสดงให้เห็นว่า ลำต้นและใบของหนามพุงดอและหนามแดง และดอกและใบของขลู่ อาจนำไปพัฒนาใช้ในการกระตุ้นการทำงานของเซลล์แมโครฟาจสำหรับรักษาโรคต่าง ๆ ในผู้ที่ภูมิคุ้มกันต่ำ มีการกดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน หรือส่งเสริมการตอบสนองเมื่อมีการติดเชื้อ เช่น โรคเท้าช้าง เป็นต้น ในทางตรงกันข้าม ใบของขลู่ อาจนำมาพัฒนาเป็นยาสมุนไพร สำหรับใช้ในการรักษาบาดแผล และการต้านการอักเสบ เช่น โรคข้ออักเสบรูมาตอยด์ โรคหัวใจและหลอดเลือด เป็นต้น ดังนั้นการศึกษานี้จึงอาจนำมาซึ่งการส่งเสริมการปลูกพืชที่ไม่ได้ใช้ประโยชน์ในพื้นที่ดินเค็มเพื่อสร้างรายได้ให้เกษตรกร อย่างไรก็ตามยังคงต้องมีการศึกษากลไกการออกฤทธิ์ของสารเพิ่มเติมต่อไป