Isolation of endophytic bacteria from Gynura pseudochina (L.) DC.growing in Zn/Cd contaminated soil and the effect of endophytic bacteria to phenolic compounds

Abstract

This research aims to isolate zinc (Zn) and cadmium (Cd) tolerant endophytic bacteria from Gynura pseudochina (L.) DC., a Zn/Cd hyperaccumulative plant. In addition, the effects of the endophytes inoculation on Zn and Cd accumulation and phenolic contents in the plants were investigated in both tissue culture and pot systems including the metal stress. Seventy-three entophytic bacteria were isolated from the plant samples (tuber, stem, and leaves), which grew in a reserved forest area of a closed Zn mine, in Mae Sot district, Tak province, Thailand. All isolates were selected by streaking on trypticase soya agar (TSA) plate containing various concentrations of Zn (25, 20, 100 and 200 mg/l) and Cd (5, 10, 20 and 50 mg/l). The results showed that there were 17 isolates tolerating the high concentrations of Zn and Cd at 200 mg/l and 50 mg/l, respectively. The 16S rDNA gene identifications indicated that the bacteria isolates belonged to the genus of Acinetobacter, Curtobacterium, Yokenella, Cupriavidus, Cellulomonas, Rhizobium, Enterobacter, Stenotrophomonas, Methylobacterium, Beijerinckia, Chryseobacterium, Klenkia and Marmoricola. However, nine bacterial strains that tolerated the dual stress with Zn (200 mg/l) plus Cd (50 mg/l) were selected for study their plant-growth promoting properties under the metal stress. These results indicated that the Zn plus Cd stress induced the production of siderophore and indole-3-acetic acid by S. maltophilia GSD10 and Chryseobacterium sp. GTID13. In addition, Curtobacterium sp. GLD03, S. maltophilia GSD10 and Chryseobacterium sp. GTID13, which have had no reports of pathogenicity, were selected for monitoring the bacterial inoculation affecting on G. pseudochina plants. In tissue culture system, Curtobacterium sp. GLD03, S. maltophilia GSD10 and Chryseobacterium sp. GTID13 were separately inoculated into the plants, then cultivated for one-month before dual treatment with Zn (100 mg/l) plus Cd (15 mg/l) for the next two weeks. In pot system, the three endophytes were separated inoculated into the tubers before growing in a fertile soil supplemented with Zn 1,000 mg/kg soil plus Cd 50 mg/kg soil for 2 months. The plant growth, accumulation of Cd and Zn in roots and shoots, and phenolic compounds in leaves were investigated. The results obtained from the tissue culture system were not significant difference in the effects of the bacterial inoculation, because the high humidity might decrease the plants’ stress. In focusing, the results from the pot system indicated that S. maltophilia GSD10 increased Zn and Cd accumulation in roots, whereas Curtobacterium sp. GLD03 and Chryseobacterium sp. GTID13 increased amounts of Zn and Cd in the shoot. The three strains could colonize in the stem and root tissues. The picture of GFP-labelled S. maltophilia GSD10 colonizing on the surfaces of the primary root tissue under the confocal microscope represented the colonization. In comparison with the phenolic compounds of the leaf extracts from the plants treated with Zn plus Cd, the inoculation of Curtobacterium sp. GLD03 and S. maltophilia GSD10 resulted to decrease total phenolic content (TPC) and total flavonoid content (TFC) in the leaf extracts. Whereas, TPC and TFC of the leaf extracts from the plants inoculated with Chryseobacterium sp. GTID13 were similar to the extracts from the control plants, without bacterial inoculation. In addition, the leaf extracts of the plant are inoculated with Chryseobacterium sp. GTID13 had the highest radical scavenging activity. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) showed that chromatogram of the leaf extracts had similarly with four main peaks of chlorogenic acid (CGA), caffeic acid (CA), rutin (RUT) and unknown compound. The inoculation of Curtobacterium sp. GLD03 and S. maltophilia GSD10 into the plans affected the decrease of all four main peaks. Whereas, the inoculation by Chryseobacterium sp. GTID13 might modulate the increase of CGA, RUT and unknown compound. Consequently, the results demonstrated that Chryseobacterium sp. GTID13 could be applied in a bioaugmentation process to decrease Zn/Cd phytotoxicity and support phytoextraction of the metals by growing G. pseudochina.

งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อคัดแยกเชื้อเอนโดไฟติกแบคทีเรียที่ทนโลหะสังกะสี และแคดเมียมจากต้นว่านมหากาฬ ซึ่งเป็นพืชที่มาความสามารถในการสะสมโลหะสังกะสีและแคดเมียมได้ดี นอกจากนี้ยังศึกษาผลของการปลูกเชื้อเอนโดไฟติกแบคทีเรียต่อการสะสมโลหะสังกะสีและแคดเมียม และปริมาณของสารประกอบฟีโนลิกของต้นว่านมหากาฬ โดยศึกษาทั้งการปลูกในขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชและการปลูกในกระถางภายใต้การสภาวะเครียดจากโลหะหนัก ผลการศึกษาพบว่าสามารถคัดแยกเชื้อเอนโดไฟติกแบคทีเรียจำนวน 73 ไอโซเลต จากส่วนหัว ลำต้น และใบของต้นว่านมหากาฬที่เจริญในพื้นที่ป่าในบริเวณเหมืองสังกะสี อำเภอแม่สอด จังหวัดตาก ประเทศไทย เชื้อเอนโดไฟติกแบคทีเรียทั้งหมดถูกคัดแยกโดยใช้ความสามารถในการทนโลหะบนอาหาร Trypticase Soya Agar ที่เติมโลหะสังกะสีเข้มข้น 25 20 100 และ 200 มิลลิกรัมต่อลิตร และแคดเมียมที่ความเข้มข้น 5, 10, 20 และ 50 มิลลิกรัมต่อลิตร ผลการทดลองพบว่ามีเชื้อเอนโดไฟติกแบคทีเรียจำนวน 17 ไอโซเลต สามารถทนโลหะสังกะสีที่ระดับ 200 มิลลิกรัมต่อลิตร และแคดเมียมที่ระดับ 50 มิลลิกรัมต่อลิตร การจัดจำแนกชนิดแบคทีเรียด้วยลำดับเบสของยีน 16S rDNA พบเป็นแบคทีเรียในสกุล Acinetobacter, Curtobacterium, Yokenella, Cupriavidus, Cellulomonas, Rhizobium, Enterobacter, Stenotrophomonas, Methylobacterium, Beijerinckia, Chryseobacterium, Klenkia, และ Marmoricola โดยแบคทีเรียจำนวน 9 สายพันธุ์ ที่สามารถทนต่อความเครียดในสถาวะที่มีทั้งโลหะสังกะสี 200 มิลลิกรัมต่อลิตร และแคดเมียม 50 มิลลิกรัมต่อลิตร ถูกนำไปศึกษาคุณสมบัติการส่งเสริมการเจริญของพืชภายใต้ความเครียดของโลหะสังกะสีร่วมกับแคดเมียม พบว่าการผลิตกรดอินโดล-3-แอซีติก และผลิตไซเดอร์โฟอร์ของ S. maltophilia GSD10 และ Chryseobacterium sp. GTID13 ถูกกระตุ้นให้ผลิตเพิ่มขึ้นภายใต้ความเครียดของโลหะ และคัดเลือก Curtobacterium sp. GLD03, S. maltophilia GSD10 และ Chryseobacterium sp. GTID13 ไปศึกษาผลการปลูกเชื้อที่มีต่อต้นว่านมหากาฬ

การปลูกในขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชทำโดยปลูกเชื้อ Curtobacterium sp. GLD03 S. maltophilia GSD10 และ Chryseobacterium sp. GTID13 ในต้นพืชนาน 1 เดือน และเติมโลหะสังกะสีร่วมกับแคดเมียมให้มีความเข้มข้น 100 มิลลิกรัมต่อลิตร และ 15 มิลลิกรัมต่อลิตร ตามลำดับ ทดลองนานสองสัปดาห์ก่อนเก็บผล การปลูกในกระถางทำโดยปลูกเชื้อในส่วนหัวของว่านมหากาฬก่อนนำไปปลูกในดินที่มีโลหะสังกะสีร่วมกับแคดเมียม 1,000 มิลลิกรัมต่อกิโลกรัมดิน และ 50 มิลลิกรัมต่อกิโลกรัมดิน ทดลองนานสองเดือน โดยศึกษาการเจริญ การสะสมโลหะสังกะสีและแคดเมียมในรากและส่วนหนือราก และปริมาณสารประกอบฟีโนลิกในส่วนใบ เปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่ไม่ได้ปลูกเชื้อเอนโดไฟติกแบคทีเรีย ผลการศึกษาในขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อให้ผลไม่ชัดเจนอาจเนื่องจากเป็นระบบที่มีสภาพแวดล้อมมีความชื้นสูงและช่วยลดความเครียดของพืช ผลการทดลองในกระถางพบว่า S. maltophilia GSD10 ช่วยเพิ่มปริมาณการสะสมโลหะสังกะสีและแคดเมียมในส่วนราก ในขณะที่ Curtobacterium sp. GLD03 และ Chryseobacterium sp. GTID13 เพิ่มปริมาณการสะสมโลหะสังกะสีและแคดเมียมในส่วนเหนือราก แบคทีเรียทั้งสามสายพันธุ์สามารถครอบครองได้ในเนื้อเยื่อพืชทั้งในส่วนรากและส่วนเหนือราก ยืนยันด้วยภาพถ่ายภายใต้กล้องคอลโฟคอลแสดงการครอบครองบริเวณเนื้อเยื่อรากปฐมภูมิของเชื้อ S. maltophilia GSD10 ที่ติดฉลาก GFP ยีน และเมื่อเปรียบเทียบปริมาณสารประกอบฟีโนลิกของสารสกัดส่วนใบของว่านมหากาฬในสภาวะเครียดที่เติมโลหะสังกะสีร่วมกับแคดเมียมพบว่า พืชที่ปลูกด้วยเชื้อ Curtobacterium sp. GLD03 และ S. maltophilia GSD10 มีปริมาณสารประกอบฟีโนลิก และปริมาณสารประกอบฟลาโวนอยด์ลดลง ในขณะที่พืชที่ปลูกด้วยเชื้อ Chryseobacterium sp. GTID13 ให้ผลของปริมาณสารประกอบฟีโนลิก และปริมาณสารประกอบฟลาโวนอยด์ใกล้เคียงกับพืชกลุ่มควบคุมที่ไม่ได้ปลูกเชื้อเอนโดไฟติกแบคทีเรีย นอกจากนี้ผลการศึกษาฤทธิ์การต้านสารอนุมูลอิสระพบว่า สารสกัดจากพืชที่ปลูกด้วยเชื้อ Chryseobacterium sp. GTID13 ให้ค่าการยับยั้งอนุมูลอิสระดีพีพีเอชสูงที่สุด โครมาโตแกรมจากการวิเคราะห์ด้วยเทคนิค High Performance Liquid Chromatography แสดงให้เห็นว่าสารสกัดจากใบว่านมหากาฬประกอบด้วย 4 พีคหลักของ คลอโรจีนิกแอซิด คาเฟอิกแอซิด รูทิน และสารที่ยังมาสามารถระบุชนิดได้ โดยสารหลักทั้งสี่ในพืชที่ปลูกด้วยเชื้อ Curtobacterium sp. GLD03 และ S. maltophilia GSD10 มีปริมาณลดลง และการปลูกเชื้อ Chryseobacterium sp. GTID13 ในพืชมีแนวโน้มช่วยเพิ่มปริมาณ คลอโรจีนิกแอซิด รูทิน และสารที่ยังไม่สามารถระบุชนิดได้ ดังนั้นเชื้อ Chryseobacterium sp. GTID13 จึงสามารถนำมาประยุกต์ใช้ในกระบวนการเติมจุลินทรีย์เพื่อช่วยลดความเป็นพิษของสังกะสีและแคดเมียม และสนับสนุนกระบวนการสะสมโลหะของต้นว่านมหากาฬ