Screening of Effective Antagonistic Bacillus spp. and Streptomyces spp. from Soil for Controlling of Tomato Fusarium Wilt Disease and Promoting of Plant Growth

Abstract

In this study, 11 isolates of Bacillus spp. and 86 isolates of Streptomyces spp. were isolated from soils in Buriram province, and they were then assessed for their antagonistic activity against Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol), the causal agent of tomato Fusarium wilt disease, as well as their broad-spectrum by dual culture technique and their plant growth-promoting (PGP) activity were also investigated. The results showed that only 9 isolates, 4 isolates of Bacillus (B.PNR1, B.PNR2, B.KK3 and B.PB1) and 5 isolates of Streptomyces (S.PNR29, S.PNR30, S.PNR74, S.KK1, and S.PB5) expressed the percentage of growth inhibition more than 50%. Moreover, the antagonistic bacteria Bacillus and Streptomyces were also showed broad-spectrum activity against the othor 9 isolates of Fol, 1 isolate of Sclerotium rolfsii, 10 isolates of Fusarium oxysporum f.sp. cubense (Foc) race 1, 2 isolates of Colletotrichum gloeosporioides, 1 isolate of C. musae and 1 isolate of phytopathogenic bacterium Ralstonia solanacearum. In vitro and in vivo experiment, the preventative approaches gave good results and significantly in inhibiting of Fol in tomato plants than those of the curative approaches. Especially, culture filtrates and cell suspensions of antagonistic bacteria isolates B.PNR1, B.PNR2, B.KK3, S.PNR29, and S.PNR74 gave good ability to protect the tomato plant from the fungal pathogen by reducing the disease severity. In addition, these antagonist bacterial isolates have the activity to produce extracellular enzymes (amylase, cellulase, and ligninase) involved in inhibiting the growth of the plant pathogenic fungi under in vitro condition. The culture filtrate of these bacterial isolates could disturb the fungal cell wall after electron microscope observation. In addition, antagonistic bacteria had the IAA production and the phosphate solubilization involved in tomato growth promotion. For the plant growth promoting activity, the results showed that the culture filtrates and cell suspensions of the antagonistic Bacillus isolates B.PNR1 and Streptomyces isolate S.PNR29 had the best activity to enhance the seed germination rate and promote the tomato growth under in vitro and in vivo experiments, respectively. The shoot and root dry weight, and shoot length of tomato plants treated with the culture filtrate and cell suspension of Bacillus isolate B.PNR1 was significantly higher than those of the control treatment. Moreover, the antagonistic Bacillus isolate B.PNR1 and Streptomyces isolate S.PNR29 were used to develop a bioproduct for controlling Fusarium wilt disease, tomato seed germination, and tomato growth. The results showed that the B.PNR1 and S.PNR29 bioproducts had the activity to control the Fusarium wilt disease, enhance the seed germination rate, and promote tomato growth. Among them, the B.PNR1 bioproduct gave the best activity with low disease severity score compared to the commercial Bacillus bioproduct. The disease control rates of B.PNR1 was 68%. The bioproduct from Streptomyces isolate S.PNR29 was able to control Fusarium wilt disease as well as commercial Streptomyces bioproduct. Based on the best antifungal and plant growth promoting activity, the antagonistic Bacillus isolates B.PNR1 and Streptomyces isolate S.PNR29 were identified by 16S rRNA sequencing and whole genome sequencing. The Bacillus isolate B.PNR1 was identified as B. stercoris isolate B.PNR1. The isolate S.PNR29 was identified and assigned as bacteria in the genus Streptomyces. In addition, the genome studies showed that the genome of Bacillus isolate B.PNR1 and Streptomyces isolate S.PNR29 contained genes related to biosynthetic gene clusters (BGCs), such as the production of antibiotics and genes related to growth-promoting properties. Therefore, the bacteria B. stercoris B.PNR1 and Streptomyces sp. isolate S.PNR29 would be used as an antagonistic bacteria against the Fusarium wilt pathogen and promoting of the growth of tomato.

งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาเชื้อแบคทีเรีย Bacillus จำนวน 11 ไอโซเลท และ Streptomyces จำนวน 86 ไอโซเลท ที่คัดแยกจากดินในจังหวัดบุรีรัมย์ต่อการยับยั้งเชื้อรา Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici (Fol) สาเหตุโรคเหี่ยวเหลืองของมะเขือเทศ การทดสอบคุณสมบัติการเป็น broad-spectrum และการส่งเสริมการเจริญเติบโตของมะเขือเทศพบว่า เชื้อแบคทีเรียปฏิปักษ์ที่มีค่าร้อยละการยับยั้งเชื้อรา Fol มากกว่าร้อยละ 50 มีจำนวน 9 ไอโซเลท เป็นเชื้อแบคทีเรียปฏิปักษ์ Bacillus จำนวน 4 ไอโซเลท (B.PNR1, B.PNR2, B.KK3 และ B.PB1) และ Streptomyces spp. จำนวน 5 ไอโซเลท (S.PNR29, S.PNR30, S.PNR74, S.KK1 และ S.PB5) และเชื้อยังมีคุณสมบัติในการเป็น broad-spectrum โดยสามารถยับยั้งเชื้อราและเชื้อแบคทีเรียสาเหตุโรคพืชได้ ได้แก่ สามารถยับยั้งเชื้อรา S. rolfsii 1 ไอโซเลท เชื้อรา Foc race1 จำนวน 10 ไอโซเลท เชื้อรา C. gloeosporioides 2 ไอโซเลท เชื้อรา C. musae 1 ไอโซเลท และเชื้อแบคทีเรีย Ralstonia solanacearum จำนวน 1 ไอโซเลท เมื่อศึกษาประสิทธิภาพน้ำเลี้ยงเชื้อและเซลล์แขวนลอยของเชื้อแบคทีเรียปฏิปักษ์ทั้ง 9 ไอโซเลท ต่อการป้องกันและควบคุมเชื้อรา Fol ไอโซเลท TFPK401 สาเหตุโรคเหี่ยวเหลืองของมะเขือเทศในระดับห้องปฏิบัติการและกระถางพบว่า น้ำเลี้ยงเชื้อและเซลล์แขวนลอยของเชื้อแบคทีเรียปฏิปักษ์สามารถป้องกันการเกิดโรคเหี่ยวเหลืองได้ดีกว่าการควบคุม โดยเฉพาะการใช้น้ำเลี้ยงเชื้อและเซลล์แขวนลอยของเชื้อแบคทีเรียปฏิปักษ์ไอโซเลท B.PNR1, B.PNR2, B.KK3, S.PNR29 และ S.PNR74 มีประสิทธิภาพดีที่สุดในป้องกันการเกิดโรค และสามารถลดระดับความรุนในการเกิดโรคเหี่ยวเหลืองในมะเขือเทศได้ โดยเชื้อแบคทีเรียปฏิปักษ์ดังกล่าวสามารถผลิต extracellular enzymes (amylase, cellulase และ ligninase) ที่เกี่ยวข้องกับการยับยั้งการเจริญของเชื้อราสาเหตุโรคพืชได้ในสภาพห้องปฏิบัติการ และน้ำเลี้ยงเชื้อแบคทีเรียปฏิปักษ์สามารถทำลายผนังเซลล์ของเชื้อราสาเหตุโรคเมื่อตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน นอกจากนั้นเชื้อยังมีคุณสมบัติในการละลายฟอสเฟต และการผลิตฮอร์โมน IAA ที่เกี่ยวข้องกับการส่งเสริมการเจริญเติบโตของมะเขือเทศ และจากการศึกษาคุณสมบัติน้ำเลี้ยงเชื้อและเซลล์แขวนลอยของเชื้อแบคทีเรียปฏิปักษ์ทั้ง 9 ไอโซเลท ต่อการส่งเสริมการงอก และการส่งเสริมการเจริญเติบโตของมะเขือเทศทั้งในระดับห้องปฏิบัติการและกระถางพบว่า พบว่าน้ำเลี้ยงเชื้อและเซลล์แขวนลอยของเชื้อแบคทีเรียปฏิปักษ์ Bacillus ไอโซเลท B.PNR1 และ Streptomyces ไอโซเลท S.PNR29 มีแนวโน้มกระตุ้นการงอกของเมล็ด และส่งเสริมการเจริญเติบโตของมะเขือเทศได้ดีที่สุด โดยเฉพาะการใช้น้ำเลี้ยงเชื้อและเซลล์แขวนลอยของเชื้อแบคทีเรียปฏิปักษ์ Bacillus ไอโซเลท B.PNR1 ที่ส่งเสริมให้ค่าน้ำหนักแห้งของ ลำต้น น้ำหนักแห้งของราก และค่าความยาวของลำต้นมะเขือเทศดีกว่าและแตกต่างจากชุดควบคุมอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ นอกจากนี้เมื่อนำเซลล์แขวนลอยของเชื้อแบคทีเรีย Bacillus ไอโซเลท B.PNR1 และ Streptomyces ไอโซเลท S.PNR29 มาผลิตสารชีวภัณฑ์แบบผงพบว่า สารชีวภัณฑ์ที่ผลิตจากเชื้อแบคทีเรียปฏิปักษ์ทั้ง 2 ไอโซเลท มีประสิทธิภาพในการป้องกันการเกิดโรคเหี่ยวเหลืองในมะเขือเทศ สามารถส่งเสริมการงอก และการเจริญเติบโตของมะเขือเทศได้ โดยเฉพาะสารชีวภัณฑ์จากเชื้อแบคทีเรีย Bacillus ไอโซเลท B.PNR1 สามารถป้องกันการเกิดโรคเหี่ยวเหลืองในมะเขือเทศได้ดีที่สุด สามารถลดระดับความรุนแรงของโรคได้ดีกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับสารชีวภัณฑ์ทางการค้า โดยสามารถป้องกันการเกิดโรคเหี่ยวเหลืองในมะเขือเทศได้ถึงร้อยละ 68 ส่วนสารชีวภัณฑ์จากเชื้อแบคทีเรียปฏิปักษ์ Streptomyces S.PNR29 สามารถลดการเกิดโรคเหี่ยวเหลืองในมะเขือเทศได้ดีเทียบเท่ากับสารชีวภัณฑ์การค้า Streptomyces และเมื่อทำการระบุชนิดเชื้อแบคทีเรีย Bacillus ไอโซเลท B.PNR1 และ Streptomyces ไอโซเลท S.PNR29 ด้วยข้อมูลของยีน 16S rRNA และการวิเคราะห์ข้อมูลจีโนมทั้งหมดของเชื้อด้วยการหาค่าดัชนีนิวคลีโอไทด์โดยเฉลี่ย (ANIb) และค่า digital DNA-DNA hybridization (dDDH) พบว่าสามารถระบุชนิดแบคทีเรียปฏิปักษ์ Bacillus ไอโซเลท B.PNR1 ว่าเป็นเชื้อ B. stercoris ไอโซเลท B.PNR1 ส่วนแบคทีเรียปฏิปักษ์ Streptomyces ไอโซเลท S.PNR29 จัดอยู่ในสกุล Streptomyces โดยเมื่อวิเคราะห์จีโนมของเชื้อแบคทีเรียปฏิปักษ์ทั้ง 2 ไอโซเลท พบว่าเชื้อทั้ง 2 ไอโซเลท มีกลุ่มยีนที่เกี่ยวข้องกับการผลิตสารสังเคราะห์ทางชีวภาพ เช่น สารปฏิชีวนะ และสารส่งเสริมการเจริญเติบโตของพืช ดังนั้นเชื้อแบคทีเรีย B. stercoris ไอโซเลท B.PNR1 และ Streptomyces ไอโซเลท S.PNR29 จึงเป็นเชื้อแบคทีเรียที่สามารถใช้ในการเป็นเชื้อปฏิปักษ์ต่อเชื้อราสาเหตุโรคเหี่ยวเหลือง และมีคุณสมบัติในการส่งเสริมการเจริญเติบโตของมะเขือเทศ