Composition and Antimicrobial Activity of Defensive Secretions of the Giant Millipede Anurostreptus sculptus Demange, 1961 (Diplopoda : Spirostreptida : Harpagophoridae)

Abstract

The defensive secretions of the giant millipede Anurostreptus sculptus (Diplopoda: Spirostreptida) contain benzoquinone as a major chemical component. The present work aims to further examine the chemical composition of the defensive secretions of this species and their antimicrobial activity. To this end, the repugnatorial glands were extracted by soaking the glands in different chemical solutions to increase the polarity viz., hexane, ethyl acetate, and methanol. Moreover, fresh defensive secretions derived directly from the repugnatorial glands were also tested. The chemical composition of defensive secretions was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Two main components were found in fresh secretions: 1) bicyclo(3.3.1)nonane-2,6-dione (58.58%), which was demonstrated for the first time in millipedes and 2) 2-methyl-p-benzoquinone (15.71%), the common benzoquinone found in juliform millipedes. The three polarizing solutions, furthermore demonstrated the presence of (Z)-9-octadecenamide as a major component (80.02%, 54.87% and 58.33%, respectively). Antimicrobial activity was tested with three gram-positive bacteria (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus and Staphylococcus aureus DMST20654), four gram-negative bacteria (Escherichia coli, Escherichia coli ATCC25922, Pseudomonas aeruginosa and Salmonella Typhi ATCC16122), and two yeast strains (Candida albicans and Candida albicans ATCC10231). A broth microdilution technique indicated that all gram-positive bacteria and C. albicans were inhibited by three extracted secretions with a minimum inhibitory concentration (MIC) ranged from 0.25 to 2.00 mg/mL and with a minimum bactericidal concentration (MBC) of 2.00 mg/mL for gram positive-bacteria. The strongest inhibition was found in fresh secretions which inhibit all microbes tested in this study with a MIC of 0.002 - 0.250% (v/v) and with an MBC for gram-positive and gram-negative bacteria in the range of 0.063 - 0.125 and 0.250 - 0.500% (v/v), respectively. The minimum fungicidal concentration (MFC) ranged from 0.0039 to 0.0078% (v/v). Fresh secretions were more effective in inhibiting and killing yeast than fluconazole.

กิ้งกือยักษ์ Anurostreptus sculptus จัดอยู่ในอันดับ Spirostreptida เป็นกิ้งกือในกลุ่มกิ้งกือกระบอก Superorder Juliformia ร่วมกับอันดับ Spirobolida และ Julida ที่มีสารคัดหลั่งป้องกันตัวกลุ่มเบนโซควิโนน (benzoquinone) เป็นสารประกอบหลัก การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาองค์ประกอบทางเคมีของสารคัดหลั่งป้องกันตัว และฤทธิ์การต้านจุลชีพจากกิ้งกือสปีชีส์นี้ โดยสกัดสารคัดหลั่งป้องกันตัวจากต่อม repugnatorial ในตัวทำละลายจากความมีขั้วน้อยไปหาความมีขั้วมาก ได้แก่ เฮกเซน เอทิลแอซีเทต และเมทานอล นอกจากนี้ยังทดสอบสารคัดหลั่งป้องกันตัวที่ได้จากต่อมโดยตรงที่ไม่ผ่านการสกัดด้วย องค์ประกอบทางเคมีของสารคัดหลั่งป้องกันตัววิเคราะห์ด้วยเทคนิคแก๊สโครมาโทกราฟี-แมสสเปกโทรเมทรี (GC-MS) พบว่าคัดหลั่งป้องกันตัวที่ได้จากต่อมโดยตรงมีสารองค์ประกอบหลัก 2 ชนิด ได้แก่ bicyclo(3.3.1)nonane-2,6-dione (58.58 เปอร์เซ็นต์) ซึ่งเป็นครั้งแรกที่พบในกิ้งกือ และ 2-methyl-p-benzoquinone (15.71 เปอร์เซ็นต์) ซึ่งเป็นสารควิโนนหลักที่พบในสารคัดหลั่งป้องกันตัวของกิ้งกือกลุ่มกิ้งกือกระบอก ส่วนในสารสกัดชั้นเฮกเซน เอทิลแอซีเทต และเมทานอล พบ (Z)-9-octadecenamide เป็นองค์ประกอบหลัก การทดสอบฤทธิ์การต้านจุลชีพทำการทดสอบกับแบคทีเรียแกรมบวก 3 สายพันธุ์ (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus และ Staphylococcus aureus DMST20654) แบคทีเรียแกรมลบ 4 สายพันธุ์ (Escherichia coli, Escherichia coli ATCC25922, Pseudomonas aeruginosa และ Salmonella Typhi ATCC16122) และยีสต์ 2 สายพันธุ์ (Candida albicans และ Candida albicans ATCC10231) การทดสอบด้วยวิธี broth microdilution พบว่าสารสกัดทั้ง 3 ชนิด สามารถยับยั้งแบคทีเรียแกรมบวกและ C. albicans ได้ โดยมีค่า MIC อยู่ในช่วง 0.25 - 2.00 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร และมีค่า MBC ต่อเชื้อแบคทีเรียแกรมบวก 2.00 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ส่วนสารคัดหลั่งป้องกันตัวที่ได้จากต่อมโดยตรงสามารถยับยั้งเชื้อทดสอบได้ทั้งหมด โดยมีค่า MIC อยู่ในช่วง 0.002 - 0.250 เปอร์เซ็นต์ (v/v) ค่า MBC สำหรับแบคทีเรียแกรมบวก และแบคทีเรียแกรมลบอยู่ในช่วง 0.063 - 0.125 และ 0.250 - 0.500 เปอร์เซ็นต์ (v/v) ตามลำดับ และค่า MFC อยู่ในช่วง 0.0039 - 0.0078 เปอร์เซ็นต์ (v/v) โดยสามารถยับยั้ง และทำลายยีสต์ได้อย่างมีประสิทธิภาพมากกว่ายาปฏิชีวนะฟลูโคนาโซล