Molecular Phylogeny, Systematics, Antioxidant and Antibacterial Activities ofLichenized fungi genus Usnea in Northern Thailand

Abstract

This research aims to 1) identify species of the genus Usnea from Northern Thailand by using morphological, anatomical, chemical characteristics, and molecular analysis 2) evaluate the potential of antioxidant and antibacterial activities, and 3) phytochemistry analysis within total phenolic compound, total flavonoid compound, and tannin. The studies of molecular phylogeny utilized ITS rDNA as a primer, and genomic DNA was extracted using plant DNA extraction mini kits. DNA sequencing was conducted at Macrogen, followed by alignment and phylogenetic tree reconstruction using the MEGA-X program. The crude extract of Usnea himantodes and Usnea cf. pectinata from 4 different solvents is macerated with 95% ethanol, acetone, and ethyl acetate, and boiling water. Antioxidant activities using DPPH, ABTS, and FRAP assays. Agar well diffusion using for antibacterial activity with 4 bacterial species, such as B. cereus TISTR 1449, Staphylococcus epidermidis TISTR 2162, Escherichia coli TISTR 527, and Pseudomonas aeruginosa TISTR 1287. Total phenolics and tannin content using the Folin-Ciocaltue method, whereas flavonoids using Aluminum chloride colorimetric assay. The results show 12 species identified including U. aciculifera Vain., U. articulata (L.) Hoffm., U, baileyi (Stirt.) Zahlbr., U. ceratina Ach., Usnea cf. dendritica Stirt, U. himantodes Stirt., U. pangiana Stirt., Usnea cf. perhispidella J. Steiner, Usnea cf. pectinata, U. rubicunda Stirt., Usnea cf. rubicunda, and U. shimadae Asahina. Only U. aciculifera Vain supported with molecular data of ITS region. The results of the antibacterial activities show that the extract of boiling water of U. himantodes and Usnea cf. pectinata had the lowest IC50 of 0.759±0.036 and 0.741±0.021 mg/ml in DPPH assay, ABTS assay having an IC50 of 0.765±0.018 and 1.001±0.005 mg/ml, and the FRAP value being 30.069±0.211 and 27.927±0.129 mg FeSO4/g extract. The antibacterial properties show that ethanolic, acetone, and ethyl acetate extracts can inhibit B. cereus TISTR 1449, S. epidermidis TISTR 2162, and E. coli TISTR 527, but cannot effectively against P. aeruginosa TISTR 1287 with MIC and MBC values of 20 mg/ml. The phytochemistry analysis showed that ethanolic extract of U. himantodes and Usnea cf. pectinata contained the highest total phenolic content (84.430±1.385 and 93.772±2.847 mg Gallic acid/g Extract), total flavonoid content (21.595±1.138 and 36.847±0.613 mg Quercetin/g Extract), and tannin content (81.418±1.341 and 90.467±2.784 mg Tannic acid/g Extract). This study demonstrates the antioxidant and antibacterial effects of Usnea lichen extracts, providing insights for potential applications in various industries. These findings provide valuable insights for future development and application in pharmaceutical and food industries, enhancing the use of natural products for health-related benefits.

งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อ 1) ระบุชนิดของไลเคนสกุล Usnea ในภาคเหนือของประเทศไทยโดยใช้ลักษณะทางสัณฐานวิทยา โครงสร้างภายใน สารเคมี และการวิเคราะห์ข้อมูลเชิงโมเลกุล 2) เพื่อศึกษาศักยภาพฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและฤทธิ์ยับยั้งแบคทีเรียของสารสกัดหยาบไลเคนสกุล Usnea รวมไปถึง 3) วิเคราะห์ปริมาณสารประกอบฟีนอลิก ฟลาโวนอยด์ และแทนนิน การศึกษาข้อมูลเชิงโมเลกุลใช้บริเวณ ITS rDNA เป็นไพรเมอร์ สกัดดีเอ็นเอด้วยชุดสกัดและวิเคราะห์ลำดับเบสโดย Macrogen เปรียบเทียบลำดับเบสและสร้างสายวิวัฒนาการด้วยโปรแกรม MEGA-X การศึกษาฤทธิ์ทางชีวภาพดำเนินการโดยสกัดตัวอย่างไลเคน Usanea himantodes และ Usnea cf. pectinata ด้วยตัวทำละลาย 4 ชนิด ได้แก่ เอทานอลร้อยละ 95 อะซิโตน เอทิลอะซิเตท และน้ำร้อน ทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ 3 วิธี ได้แก่ วิธี DPPH ABTS และ FRAP ทดสอบการยับยั้งแบคทีเรีย 4 ชนิด ได้แก่ B. cereus TISTR 1449, Staphylococcus epidermidis TISTR 2162, Escherichia coli TISTR 527, and Pseudomonas aeruginosa TISTR 1287 ด้วยวิธี Agar well diffusion และวิธี Broth microdilution ในการหาความเข้มข้นต่ำสุดที่ยับยั้งแบคทีเรีย (Minimum Inhibitory Concentration; MIC) และ ความเข้มข้นต่ำสุดที่ฆ่าแบคทีเรีย (Minimum Bactericidal Concentration; MBC) นอกจากนี้การวิเคราะห์ปริมาณสารประกอบฟีนอลิกและแทนนินด้วยวิธี Folin-Ciocaltue และวิเคราะห์ปริมาณฟลาโวนอยด์ด้วยวิธี Aluminum chloride colorimetric การศึกษาระบุชนิดไลเคนสกุล Usnea สามารถระบุชนิดไลเคนได้ 12 ชนิด ได้แก่ U. aciculifera Vain., U. articulata (L.) Hoffm., U, baileyi (Stirt.) Zahlbr., U. ceratina Ach., Usnea cf. dendritica Stirt, U. himantodes Stirt., U. pangiana Stirt., Usnea cf. perhispidella J. Steiner, Usnea cf. pectinata, U. rubicunda Stirt., Usnea cf. rubicunda, and U. shimadae Asahina มีเพียงไลเคนชนิด U. aciculifera Vain เท่านั้นที่ถูกยืนยันผลด้วยข้อมูลเชิงโมเลกุลบริเวณ ITS ผลการศึกษาฤทธิ์ทางชีวภาพของสารสกัดจากไลเคนพบว่าสารสกัดด้วยน้ำร้อนของไลเคน U. himantodes and Usnea cf. pectinata มีค่า IC50 ต่ำที่สุดเท่ากับ 0.759±0.036 และ 0.741±0.021 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตรในวิธี DPPH assay ในขณะที่วิธี ABTS assay มีค่า IC50 เท่ากับ 0.765±0.018 และ 1.001±0.005 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร และในวิธี FRAP assay มีค่า FRAP value เท่ากับ 30.069±0.211 และ 27.927±0.129 มิลลิกรัมเฟอรัสซัลเฟตต่อกรัมสารสกัดหยาบตามลำดับ การทดสอบการยับยั้งแบคทีเรีย พบว่าสารสกัดด้วยเอทานอลร้อยละ 95 อะซิโตน และเอทิลอะซิเตท สามารถยับยั้งแบคทีเรีย Bacillus cereus TISTR 1449, Staphylococcus epidermidis TISTR 2162 และ Escherichia coli TISTR 527 ได้ แต่ไม่สามารถยับยั้งการเจริญของ Pseudomonas aeruginosa TISTR 1287 สารสกัดหยาบด้วยเอทานอลร้อยละ 95 สามารถยับยั้งและฆ่าแบคทีเรียทั้งสามชนิด มีค่า MIC และ MBC เท่ากับ 20 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ส่วนสารสกัดหยาบด้วยน้ำร้อนมีฤทธิ์ยับยั้งและฆ่าแบคทีเรียชนิดเดียวคือ B. cereus TISTR 1449 มีค่า MIC และ MBC เท่ากับ 40 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร สารสกัดด้วยเอทานอลร้อยละ 95 ของไลเคน U. himantodes and Usnea cf. pectinata พบปริมาณสารประกอบฟีนอลิกรวม (84.430±1.385 and 93.772±2.847 mg Gallic acid/g Extract) ฟลาโวนอยด์ (21.595±1.138 and 36.847±0.613 mg Quercetin/g Extract) และแทนนินสูงที่สุด (81.418±1.341 and 90.467±2.784 mg Tannic acid/g Extract) งานวิจัยนี้เป็นรายงานการทดสอบฤทธิ์ต้านนอุมูลอิสระและยับยั้งแบคทีเรียของไลเคนสกุล Usnea จากการศึกษางานวิจัยนี้ให้ข้อมูลเชิงลึกอันมีค่าที่เป็นแนวทางสำหรับการพัฒนาและการประยุกต์ใช้ในอนาคตในอุตสาหกรรมยาและอาหาร ช่วยเพิ่มการใช้ผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติมากขึ้น