Characterization of siderophore production from Pseudomonas aeruginosa PDMZnCd2003 under zinc and/or cadmium conditions and the effect of crude siderophores on Tagetes electa L. growth

Abstract

Pseudomonas aeruginosa PDMZnCd 2003 is a plant growth-promoting and Zn and Cd tolerant bacteria. This bacterial strain produced siderophores in nutrient broth (NB) (control) and NB separately containing with Zn, Cd, and Zn plus Cd. The siderophores were produced along with its bacterial growth curves. UV/visible scanning spectrophotometer of the supernatants in a range of 200-800 nm indicated that pyochelin was in control and all metals treatments, whereas pyoverdine was in the Cd and Zn plus Cd treatments. Siderophores from the medium supernatants (pH-8) and the supernatants adjusted pH to 2 (pH-2) were extracted by partition solvent extraction with ethyl acetate and n-butanol. Thin layer chromatographic (TLC) patterns showed pyochelin, pyoverdine and pseudomonine containing in the crude extracts. Pyochelin, pyoverdine chromophore, pyocyanin and pyridine-2,6-dithiocarboxylic acid (PDTC) were identified by liquid chromatography couple with mass spectrometry (LC-MS). S K-edge XANES spectra of pH-2 and pH-8 crude extracts determined by X-ray absorption fine structure (XAFS) and sulfur peak fitting indicated that multi-oxidation state of sulfur in reduced form were in the crude siderophore extracts. Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and the principle component analysis showed the difference in functional groups of oxygen (O) and sulfur (S) between pH-2 and pH-8 crude extracts. Zn K-edge XANES spectra and Cd K-edge XANES spectra analyzed with linear combination fit (LCF) indicated to their oxidation state +2, and the pH adjustment from 8 to 2 decreased the amount of Zn and Cd in the pH-2 crude extracts. Zn K-edge EXAFS and Cd K-edge EXAFS spectra indicate to O/S coordination bonding with Zn and Cd in the pH-8 crude extracts. This research clearly showed that Zn and Cd induced P. aeruginosa PDMZnCd2003 to produce more than one type of siderophores. In which, Cd induced the bacterium to produce pyoverdine for relieving the Cd toxicity.

A pot experiment was carried out by growing marigold (Tagetes electa L.) in a Zn/Cd contaminated soil and each plant groups were separately treated with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), citric acid and crude siderophore. The results showed that the providing of EDTA, citric acid and the crude siderophore improved the growth of marigold in the Zn/Cd contaminated soil. Especially, siderophore enhanced the chlorophyll content in the plants’ leaves. The EDTA increased solubility of Zn and Cd in the soil and supported Zn and Cd accumulation in shoot parts. However, citric acid and siderophore were not improved the Zn and Cd accumulation. Therefore, the unclear effect of the crude siderophore extracts on the Zn and Cd accumulations should be studied further.

Pseudomonas aeruginosa PDMZnCd2003 เป็นแบคทีเรียส่งเสริมการเจริญของพืชและทนโลหะสังกะสีและแคดเมียม ผลการศึกษาพบว่าแบคทีเรียสายพันธุ์นี้สร้างสารไซเดอร์โรฟอร์ในอาหารเลี้ยงเชื้อ Nutrient broth ทั้งสภาวะควบคุมที่ไม่มีการเติมโลหะ และสภาวะทดลองที่มีการเติมสังกะสี (Zn) แคดเมียม (Zn) และสังกะสีร่วมกับแคดเมียม แบคทีเรียสร้างสารไซเดอร์โรฟอร์ตามกราฟการเจริญของแบคทีเรีย การกราดตรวจการดูดกลืนแสงของอาหารเลี้ยงเชื้อส่วนใสที่ความยาวคลื่น 200-800 นาโนเมตร บ่งชี้ถึงสารไซเดอร์โรฟอร์ชนิดไพโอคีลิน (pyochelin) ในทุกกลุ่มทดลอง และพบชนิดไพโอเวอดิน (pyoverdine) ในกลุ่มทดลองที่เติมแคดเมียมและกลุ่มที่เติมสังกะสีร่วมกับแคดเมียม การสกัดสารไซเดอร์โรฟอร์จากส่วนใสที่มีพีเอซ 8 และส่วนใสที่ปรับพีเอซเท่ากับ 2 ทำโดยการแยกสกัดด้วยตัวทำละลายเอธิลอะซิเตตและบิวทานอล รงคเลขผิวบางของสารสกัดหยาบไซเดอร์โรฟอร์พบสารไพโอคีลิน ไพโอเวอดิน และซูโดโมนีน (pseudomonine) การวิเคราะห์ด้วยเทคนิคลิควิดโครมาโทกราฟ-แมสสเปกโทรมิเตอร์พบสารไพโอคีลิน โครโมฟอร์ของไพโอเวอดิน ไพโอไซยานิน ส่วนของสารซูโดโมนีน และ pyridine-2,6-dithiocarboxylic acid (PDTC) การวิเคราะห์สเปคตรัมของ S K-edge XANES ในสารสกัดหยาบกลุ่มพีเอช 2 และกลุ่มพีเอช 8 ด้วยเทคนิค X-ray absorption spectroscopy (XAS) และการหาสัดส่วนสูงสุดที่เหมาะสม (peak fitting) ของสเปคตรัมพบว่าซัลเฟอร์ในสารสกัดหยาบไซเดอร์โรฟอร์มีเลขออกซิเดชั่นหลายค่าและอยู่ในรูปรีดิวซ์ การวิเคราะห์ด้วยเทคนิค Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) และการวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (Principle component analysis) แสดงว่าหมู่ฟังก์ชันที่มีออกซิเจน (O) และซัลเฟอร์ (S) ของสารสกัดหยาบกลุ่มพีเอช 2 และกลุ่มพีเอช 8 มีความแตกต่างกัน การวิเคราะห์ผลรวมเชิงเส้นที่เหมาะสม (Linear combination fit) ของสเปคตรัม Zn K-edge XANES และสเปคตรัม Cd K-edge XANES บ่งชี้ว่าสังกะสีและแคดเมียมในสารสกัดหยาบกลุ่มพีเอซ 8 มีเลขออกซิเดชัน +2 และการปรับพีเอชของส่วนใสให้เท่ากับ 2 ก่อนการสกัดทำให้สังกะสีและแคดเมียมในสารสกัดหยาบลดลง โดยการวิเคราะห์สเปคตรัม Zn K-edge EXAFS และสเปคตรัม Cd K-edge EXAFS บ่งชี้ว่าสังกะสีและแคดเมียมในสารสกัดหยาบพีเอช 8 ถูกจับด้วยลิแกนด์ผสม O/S การศึกษาในครั้งนี้แสดงให้เห็นว่าสังกะสีและแคดเมียมชักนำให้ P. aeruginosa PDMZnCd2003 สร้างสารไซเดอร์โรฟอร์มากกว่าหนึ่งชนิด โดยแคดเมียมชักนำให้แบคทีเรียสร้างไพโอเวอร์ดินเพื่อลดความเป็นพิษ

การทดลองปลูกต้นดาวเรืองในกระถางและดินปนเปื้อนโลหะสังกะสีพบว่า การเติมกรดเอทิลีนไดอามีนเตตราอาเซติก กรดซิตริก และสารไซเดอร์โรฟอร์ช่วยส่งเสริมการเจริญของต้นดาวเรืองในดินปนเปื้อนโลหะหนัก ต้นดาวเรืองที่รดด้วยสารไซเดอร์โรฟอร์พบมีปริมาณคลอโรฟิลล์มากกว่าต้นที่ทดสอบด้วยสารอื่น การรดด้วยกรดซิตริกและสารไซเดอร์โรฟอร์ไม่ช่วยเพิ่มการสะสมสังกะสีและแดคเมียมในส่วนเหนือดินของต้นดาวเรือง ในขณะที่การเติมกรดเอทิลีนไดอามีนเตตราอาเซติกช่วยเพิ่มการสะสมสังกะสีและแดคเมียมในต้นดาวเรือง อย่างไรก็ตามผลของการเติมสารสกัดหยาบไซเดอร์โรฟอร์ต่อการสะสมสังกะสีและแคดเมียมในต้นดาวเรืองยังไม่แน่ชัดและควรมีการศึกษาต่อไป