Isolation characterization and selection of endophytic bacteria from Murdannia spectabilis (Kurz) Faden grown in Zn/Cd contaminated area and affect to promote plant growth under the metal stress

Abstract

This research aims to study isolation and identification of endophytic bacteria from storage roots, underground stems (tubers), leaves and peduncle of Murdannia spectabilis (Kurz) Faden growing in forest area of zinc mine, Mae Sot, Tak Province, Thailand. A total of 52 endophytic bacteria were isolated from the explants. They tolerated various concentrations of Zn and Cd, then 24 isolated surviving on Trypticase Soya Agar (TSA) adding with Zn (250-500 mg L-1) and Cd (20-50 mg L-1) were selected for bacterial identification and tested for plant growth promotion ability. The 16S rDNA gene sequencing indicated that the bacterial isolates were in genera of Bacillus, Pantoea, Microbacterium, Curtobacterium, Chryseobacterium, Cupriavidus, Siphonobacter and Pseudomonas. In addition, all of 24 isolates were able to produce IAA, the levels of IAA produced by endophytes ranged from 1.6 to 75.6 mg L-1. Only six isolates showing high IAA, phosphate and siderophore production, nitrogen fixation, ACC deaminase activity, and well-adapted to high Zn/Cd concentrations were selected for studying the plant growth promoting properties under Zn (150 mg L-1) plus Cd (30 mg L-1) stress. The results indicated that the Zn and Cd stress affected to decrease the IAA production and nitrogen fixation of RDMSSR04, RDMSP03 and RDMSP06 strains, but no effect on RDMSSR02, RDMSSR07 and RDMSSR05. Interestingly, the bacterial isolates from different parts of plant displayed different levels of Zn and/or Cd tolerances, and they could promote plant growth or confer higher tolerance to plant grown in heavy metal contaminated soil. The inoculation of Cuprividus plantarum RDMSSR05 and Chryseobacterium ureilyticum RDMSSR07 were investigated on plant growth promoting and Zn/Cd accumulation in M. spectabilis under a tissue culture system. The endophytic bacterial inoculations did not significantly affect the growth and Zn/Cd accumulation in plant. The endophytic bacterial inoculants could not survive in plants over the experimental period. Moreover, Curtobacterium luteum, an indigenous endophytic bacterium, was found in this study, and the bacterium might correlate to the mechanism of plant tolerance and to metals detoxification mechanisms.

The effects of Zn or Cd tolerance and accumulation in M. spectabilis were studied after 4 weeks when treated with Zn (50-1,000 mg L-1) and Cd (5-50) mg L-1. Fresh weight, dry weight, the number of tubers and the percentage of yellow/pale leaves and stress induction focused on chlorophyll content, protein content, cell death, total phenolic compound and stress enzymes activity (SOD, CAT) were compared between the treated and control plants. The results indicated that the concentrations of Zn 500-1,000 mg L-1 or Cd 25-50 mg L-1 affected the plant growth, increased chlorosis and stunting and decreased the chlorophyll content. In addition, higher Zn or Cd concentrations slightly caused to protein content, cell death, total phenolic compound and stress enzymes activity. The SDS-PAGE showed the effect of the toxicity of metals on protein expression. From the criteria for a metal accumulative plant, M. spectabilis could be classified as a Zn/Cd indicative plant. µ-XRF imaging indicated that the Zn was mainly distributed in the vascular bundle of the leaf tissues. In comparison with the Zn K-edge XANES spectra of the reference materials, the oxidation state of Zn accumulated in the leaves was 2+ (Zn2+). The EXAFS presented the first coordination shell was both Zn-O and Zn-S ligands.

งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อคัดแยกและจัดจำแนกชนิดของแบคทีเรียเอนโดไฟต์จากรากสะสมอาหาร ลำต้นใต้ดิน ใบ และก้านดอกของต้นแห้วกระต่ายที่เจริญในป่าบริเวณเหมืองแร่สังกะสี บริษัท ผาแดงอินดัสทรี จำกัด (มหาชน) อำเภอแม่สอด จังหวัดตาก คัดแยกเชื้อแบคทีเรียเอนโดไฟต์ได้ทั้งหมด 52 ไอโซเลต นำเชื้อทั้งหมดมาศึกษาความสามารถในการทนโลหะสังกะสีและแคดเมียม พบว่าเชื้อแบคทีเรียที่แยกได้ทุกไอโซเลตมีความทนต่อโลหะสังกะสีและแคดเมียมแตกต่างกัน และคัดเลือกแบคทีเรียเอนโดไฟต์จำนวน 24 ไอโซเลต ที่สามารถเจริญบนอาหาร Trypticase Soya Agar (TSA) ที่เติมโลหะสังกะสีเข้มข้น 250-500 มิลลิกรัมต่อลิตร และแคดเมียมเข้มข้น 20-50 มิลลิกรัมต่อลิตร ไปจัดจำแนกชนิดของแบคทีเรียด้วยลำดับเบสของยีน 16S rDNA และทดสอบคุณสมบัติส่งเสริมการเจริญของพืช ผลการจัดจำแนกชนิดพบเป็นแบคทีเรียในสกุล Bacillus, Pantoea, Microbacterium, Curtobacterium, Chryseobacterium, Cupriavidus, Siphonobacter และ Pseudomonas เชื้อทั้ง 24 ไอโซเลตยังมีความสามารถในการผลิตฮอร์โมน IAA ระหว่าง 1.6 ถึง 75.6 มิลลิกรัมต่อลิตร คัดเลือกแบคทีเรียเอนโดไฟต์ 6 ไอโซเลต ที่เจริญได้ดีในสภาวะที่มีโลหะสังกะสีและแคดเมียม และมีคุณสมบัติในการผลิตฮอร์โมน IAA ได้สูง ตรึงไนโตรเจน และ/หรือ มีความสามารถในการย่อยสลายฟอตเฟต การผลิตไซเดอร์โรฟอร์ ผลิตเอนไซม์ ACC deaminase และ สามารถย่อยสลายลิกนินได้ มาทดสอบคุณสมบัติการส่งเสริมการเจริญของพืชภายใต้สภาวะความเครียดจากโลหะสังกะสีและแคดเมียมที่ความเข้มข้น 150 และ 30 มิลลิกรัมต่อลิตร ตามลำดับ พบว่าโลหะสังกะสีและแคดเมียมส่งผลให้เชื้อไอโซเลต RDMSSR04, RDMSP03 และ RDMSP06 มีการผลิตฮอร์โมน IAA และตรึงไนโตรเจนลดลง แต่ไม่มีผลต่อเชื้อไอโซเลต RDMSSR02, RDMSSR07 และ RDMSSR05 จากผลการศึกษาแบคทีเรียเอนโดไฟต์ที่แยกได้ในแต่ละชิ้นส่วนของพืชมีความสามารถในการทนโลหะที่แตกต่างกัน ซึ่งคุณสมบัติการทนทานต่อโลหะของแบคทีเรียเอนโดไฟต์นี้อาจช่วยส่งเสริมการเจริญเติบโตของพืชและ/หรืออาจช่วยให้พืชมีความทนทานต่อโลหะหนักเมื่อเจริญในดินที่มีการปนเปื้อนของโลหะหนัก จากการศึกษาผลของแบคทีเรียเอนโดไฟต์ C. plantarum RDMSSR05 และ C. ureilyticum RDMSSR07 ต่อประสิทธิภาพในการส่งเสริมการเจริญเติบโตและการสะสมโลหะในพืช พบว่าเชื้อแบคทีเรียเอนโดไฟต์ทั้ง 2 สายพันธุ์ ให้ผลไม่เด่นชัดในการส่งเสริมการเจริญและสะสมโลหะของต้นแห้วกระต่าย แบคทีเรียเอนโดไฟต์ลดจำนวนลงเมื่อระยะเวลามากขึ้นไม่สามารถอาศัยในพืชได้ตลอดการทดลอง และยังพบเชื้อแบคทีเรีย Curtobacterium luteum เป็นเอนโดไฟต์ที่อาศัยอยู่ภายในต้นพืช ซึ่งเชื้อแบคทีเรียเอนโดไฟต์นี้อาจมีผลต่อการเจริญและสะสมโลหะของต้นแห้วกระต่าย

ความสามารถในการทนทานและสะสมโลหะสังกะสีและแคดเมียมของต้นแห้วกระต่ายภายใต้สภาวะเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ทำการศึกษาหลังจากที่รดด้วยสารละลายสังกะสีที่ความเข้มข้น 50-1,000 มิลลิกรัมต่อลิตร สารละลายแคดเมียมที่ความเข้มข้น 5-50 มิลลิกรัมต่อลิตร เป็นเวลา 4 สัปดาห์ โดยศึกษาการเจริญของพืชด้วย ค่าน้ำหนักสด น้ำหนักแห้ง จำนวนรากสะสมอาหาร และเปอร์เซ็นต์ใบเหลืองซีด และสภาวะเครียดในพืช เช่น ปริมาณคลอโรฟิลล์ โปรตีน การตายของเซลล์ราก ปริมาณสารประกอบฟีโนลิกทั้งหมด และการสร้างสารต้านอนุมูลอิสระที่อยู่ในรูปเอนไซม์ (enzymatic antioxidants), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) เป็นต้น ซึ่งจะเปรียบเทียบปัจจัยต่าง ๆ กับกลุ่มควบคุมที่ไม่มีโลหะ ผลการศึกษาพบว่าโลหะสังกะสีที่ความเข้มข้น 500-1,000 มิลลิกรัมต่อลิตร และแคดเมียมที่ 25-50 มิลลิกรัมต่อลิตร ส่งผลให้ต้นพืชแคระแกร็นและปริมาณคลอโรฟิลล์ลดลง เมื่อเปรียบเทียบความเข้มข้นของโลหะสังกะสีและแคดเมียมที่สูงขึ้น พบว่าให้ผลไม่เด่นชัดต่อปริมาณโปรตีนรวม การตายของเซลล์ราก ปริมาณสารประกอบฟีโนลิกทั้งหมด รวมถึงการสร้างเอนไซม์ SOD และ CAT ผลการศึกษาด้วย SDS-PAGE พบว่าโลหะส่งผลต่อการแสดงออกของโปรตีน ค่าการสะสมโลหะสังกะสีและแคดเมียมในส่วนต่าง ๆ บ่งชี้ว่าต้นแห้วกระต่ายจัดเป็นพืชที่มีความสามารถในการสะสมสังกะสีและแคดเมียมสูง และผลวิเคราะห์การกระจายตัวของโลหะในใบโดยเทคนิค µ-XRF แสดงการสะสมโลหะสังกะสีบริเวณมัดท่อลำเลียง สเปคตรัมการดูดกลืนรังสีเอ็กซ์ในชั้น K ของอะตอมสังกะสีในโครงสร้าง XANES พบสังกะสีที่สะสมในใบพืชมีสถานะออกซิเดชันเป็น +2 และมีแนวโน้มจับกับซัลเฟอร์ การวิเคราะห์ EXAFS พบว่าในชั้นแรกของโลหะสังกะสีจับกับธาตุซัลเฟอร์และออกซิเจน