Oil Production Using Agricultural Waste Hydrolysated by a Single Yeast Cell

Abstract

Oleaginous yeast species which can produce lipids is more being an alternative biodiesel. High productivity and controllable culture condition of oleaginous yeast are the majority to increasing consideration. Additional, renewable substrate can be used as carbon source to culture oleaginous yeast which is an inexpensive option. Therefore, this research aims to screening of oleaginous yeast and optimizing of lipid production from agricultural waste hydrolysate by oleaginous yeast using response surface methodology. The selected yeast was isolated, designated as MSU2 and Ka28 which can be used cassava pulp and sugarcane bagasse hydrolysate as feedstock, respectively. The Plackett–Burman design was considered for screening and identifying the significant variables for lipid production. The 6 parameters include total sugar, nitrogen source concentration, nutrient (10X), pH, inoculum size and temperature that each factor was prepared in two levels: -1 for low level and +1 for high level. According to the experimental results, pH, inoculum size and temperature resulted to lipid content of MSU2 by significantly (p<0.05). Three selected variables (pH, inoculum size and temperature) were further experiment in order to maximize the lipid production by the Box–Behnken design of response surface methodology. The predication by equation shows pH 6.57, 22.84% of inoculum size and temperature 26.28ºC can get lipid content at 34.56%. However, the experiment of isolated Ka28 revealed that total sugar, yeast extract concentration and nutrient (10X) were the majority parameter on maximum lipid content by significantly (p<0.05). The estimate optimum conditions using the Box–Behnken design were 53.52 g/L of total sugar, 1.25 g/L of yeast extract and 21.86 mL/100 mL of nutrient (10X) that could produce lipid content was 21.85%. Then, fatty acid content of MSU2 and Ka28 crude lipid were determined by GCMS. The results revealed palmitic acid (C16:0) and oleic acid (C18:1) as the major constituent, corresponding to 72.95 and 195.01 mg/g crude lipid by isolated MSU2 and Ka28, respectively. The D1/D2 domain of 26S rDNA sequence analysis indicated that MSU2 and Ka28 strains were highly related to Hanseniaspora uvarum (99.8%) and Meyerozyma guilliermondii (100%).

ปัจจุบันการใช้ไขมันที่ผลิตจากยีสต์สะสมไขมันเพื่อใช้ในการผลิตไบโอดีเซลได้รับความสนใจมากขึ้น เนื่องจากให้ผลผลิตสูงและสามารถควบคุมสภาวะการเพาะเลี้ยงได้ นอกจากนี้ยีสต์สะสมไขมันยังสามารถเจริญและผลิตไขมันได้โดยใช้แหล่งคาร์บอนหมุนเวียนซึ่งเป็นการลดต้นทุนการเพาะเลี้ยง ดังนั้นงานวิจัยนี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อการคัดเลือกยีสต์สะสมไขมัน และศึกษาสภาวะที่เหมาะสมต่อการผลิตไขมันจากไฮโดรไลเซทของเหลือทิ้งทางการเกษตรโดยยีสต์สะสมไขมันที่คัดเลือกได้ด้วยวิธีพื้นผิวตอบสนอง ซึ่งสามารถคัดเลือกยีสต์ได้ 2 ไอโซเลท คือ MSU2 และ Ka28 ที่สามารถใช้ไฮโดรไลเซทกากมันสำปะหลังและชานอ้อยเป็นสารตั้งต้น ตามลำดับ จากนั้นคัดเลือกปัจจัย 6 ปัจจัย ได้แก่ ปริมาณน้ำตาลทั้งหมด ความเข้มข้นแหล่งไนโตรเจน ปริมาณสารอาหารเข้มข้น 10 เท่า ความเป็นกรดด่างเริ่มต้น ปริมาณหัวเชื้อตั้งต้น และอุณหภูมิ ที่ส่งผลต่อการผลิตไขมันด้วยแผนการทดลองแบบ Plackett–Burman ที่กำหนดค่าปัจจัย 2 ระดับ คือ ระดับปัจจัยที่มีค่าต่ำ (-1) และระดับปัจจัยที่มีค่าสูง (+1) ผลการทดลองของไอโซเลท MSU2 พบว่าความเป็นกรดด่าง ปริมาณหัวเชื้อตั้งต้น และอุณหภูมิ เป็นปัจจัยที่ส่งผลต่อปริมาณไขมันสะสมในเซลล์อย่างมีนัยสำคัญ (p<0.05) นำทั้ง 3 ปัจจัย คือ ความเป็นกรดด่าง ปริมาณหัวเชื้อตั้งต้น และอุณหภูมิ มาศึกษาสภาวะที่เหมาะสมต่อการผลิตไขมันด้วยวิธีการพื้นผิวตอบสนองแบบ Box-Behnken เมื่อพิจารณาจากสมการพบว่าสภาวะที่เหมาะสมต่อการผลิตไขมันคือ ความเป็นกรดด่างเริ่มต้นเท่ากับ 6.57 ปริมาณหัวเชื้อตั้งต้นเท่ากับ 22.84% และอุณหภูมิเท่ากับ 26.28 องศาเซลเซียส จะให้ปริมาณไขมันสูงที่สุดเท่ากับ 34.56% ส่วนผลการทดลองของไอโซเลท Ka28 พบว่าปริมาณน้ำตาลทั้งหมด ความเข้มข้นสารสกัดจากยีสต์ และสารอาหารเข้มข้น 10 เท่า เป็นปัจจัยที่ส่งผลต่อปริมาณไขมันสะสมในเซลล์อย่างมีนัยสำคัญ (p<0.05) ซึ่งเมื่อศึกษาสภาวะที่เหมาะสมต่อการผลิตไขมันด้วยวิธีการพื้นผิวตอบสนองแบบ Box-Behnken จากสมการทำนายสภาวะที่เหมาะสมต่อการผลิตไขมันพบว่าที่น้ำตาลทั้งหมดเริ่มต้นเท่ากับ 53.52 กรัมต่อลิตร สารสกัดจากยีสต์เข้มข้น 1.25 กรัมต่อลิตร และสารอาหารเข้มข้น 10 เท่า ปริมาตร 21.86 มิลลิลิตรต่อ 100 มิลลิลิตร จะให้ปริมาณไขมันสูงที่สุดเท่ากับ 21.85% จากนั้นวิเคราะห์ปริมาณและชนิดของกรดไขมันที่ผลิตได้จากยีสต์ไอโซเลท MSU2 และ Ka28 ด้วยเครื่อง GCMS พบกรดไขมันหลักคือ กรดปาล์มาติก (C16:0) และกรดโอเลอิก (C18:1) ซึ่งมีปริมาณ 72.95 และ 195.01 มิลลิกรัมต่อกรัมไขมันรวม ที่ผลิตโดยยีสต์ไอโซเลท MSU2 และ Ka28 ตามลำดับ และเมื่อวิเคราะห์ข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์บริเวณ D1/D2 domain ของ 26S rDNA ในยีสต์ไอโซเลท MSU2 และ Ka28 พบว่ามีลำดับนิวคลีโอไทด์เหมือนกับ Hanseniaspora uvarum 99.8% และ Meyerozyma guilliermondii 100% ตามลำดับ