Scientific-Based Explanation of Thai Traditional Medicine Theory for Thai Traditional Herbal Remedy (A Case Study of Mo-Ha-Rak Formula)

Abstract

Thai traditional preparation (polyherbal medicine) typically contains more than two herbs, with up to 30 or more herbs. There is limited information available regarding the formulation theory of Thai traditional preparations. This study aims to provide further insights into the formulation theory underlying Thai traditional polyherbal medicine. The structure of Thai traditional preparation comprises four distinct groups of herbs, each serving different functions: primary herbs (PH), adjunct herbs (AH), supportive herbs (SH), and flavoring herbs (FH). Additionally, each group might be further divided into subgroups.

Mo-Ha-Rak (MHR), a polyherbal medicine comprising 21 medicinal plants was selected for this study. It is used by Thai traditional practitioners for the treatment of high fever. In this study, modifications of herbs in various factors of the 92 modified and original MHR of 70% ethanol extract were investigated in terms of relation to their chemicals, pharmacological activities (anti-inflammatory and antioxidant), and toxicity.

The anti-inflammatory activity of each herbal group and the combination of PH with other groups were listed as follows: PH (72.26%), PH+SH (53.47%), PH+AH (52.80%), MHR (31.32%), AH (21.39%) and SH (20.08%). The studies indicated that PH exhibits a direct anti-inflammatory effect. The combination of PH with other herbal groups displayed a lower anti-inflammatory activity.

The PH can be classified into 4 subgroups, reduced-toxic fever herbs (PH1), anti-kamdao and lohit fever herbs (PH2), anti-di fever herbs (PH3) and anti-semha and lom fever herbs (PH4). The anti-inflammatory activity of PH1 (75.92%) was not significantly different from PH (72.26%) and PH1+PH3 (72.05%) but significantly higher than PH1+PH4 (58.61%) and PH1+PH2 (39.87%). The combination of PH1 with other PH subgroups displayed different anti-inflammatory activity, PH1+PH3+PH4 (62.28%), PH1+PH2+PH3 (62.16%) and PH1+PH2+PH4 (41.13%). This study showed that herbs within the PH subgroup exhibit both synergistic and antagonistic effects.

The adjunct herbs (AH) consist of 2 subgroups: stimulant laxative (AH1) and sour-astringent laxative (AH2). The anti-inflammatory activity of PH was significantly higher than PH+AH (52.80%) and PH plus AH subgroups, PH+AH1 (46.08%) and PH+PH2 (41.53%) including AH (23.39%). The anti-inflammatory effect of AH was relatively low compared to PH and MHR. The anti-inflammatory effect of PH decreases when PH is combined with AH.

The antioxidant activity (% inhibition of NO radical scavenging) of herbal groups and their mixture were listed in the following order: AH (62.54%), MHR (61.93%), PH+ AH (60.40%), PH (56.23%), PH+SH (33.00%) and SH (28. 00%). Antioxidant activity is not directly related to PH but is directly related to AH. It may support other effects of the remedy.

The toxicity (% cell viability) of herbal groups and their mixture was listed in the following order: PH+SH (118.42%), MHR (104.64%), SH (101.67%), AH (100.31%), PH+AH (93.64%) and PH (89.47%). PH is relatively toxic to cells, especially in the PH subgroup; PH1 showed a significantly lowest % cell viability of 75.90%. SH has the potential to reduce the toxicity of PH.

Correlation analysis, most major compounds of PH were positively correlated with anti-inflammatory effects. PH revealed nine major compounds, including bergenin, chlorogenic acid, lourierin A, O-methyllaloptaeroxyrin, pectolinarigenin, perforatic acid, peucenin-7-methyl ether, resveratrol, and TT01. The TT01, resveratrol, lourierin A are major compounds in PH and demonstrated high anti-inflammatory activity, but TT01 and resveratrol showed a negative correlation to cell viability, while only lourierin A showed a positive correlation to cell viability.

This study indicates that only primary herbs exhibit a direct anti-inflammatory activity, while adjunct herbs and supportive herbs may reduce the effects of primary herbs. Increasing the number or ratio of adjunct and supportive herbs might reduce the activity of the primary herbs. In contrast, adjunct herbs may support other effects of the remedy, as well as, supportive herbs tend to reduce the toxicity of primary herbs.

The data obtained from this study aligns with the formulation theory of Thai traditional polyherbal medicine. However, the quantity and ratio of herbs within each group should be carefully adjusted to ensure the primary herbs’s efficacy is maintained.

ตามหลักการแพทย์แผนไทย ตำรับยาแผนไทยประกอบด้วยกลุ่มสมุนไพร 3-4 กลุ่ม เพื่อเสริมฤทธิ์กัน ได้แก่ กลุ่มยาหลัก (MA), กลุ่มยารอง (CMA), กลุ่มประกอบ (SMA), และกลุ่มสมุนไพรที่ใช้แต่งรส แม้จะมีหลักการนี้ แต่ก็ยังไม่มีการอธิบายรายละเอียดเกี่ยวกับจำนวนหรือปริมาณสมุนไพรที่เหมาะสมที่ใช้ในแต่ละกลุ่มสมุนไพร ตำรับยาหม้อห้ารากเป็นตำรับยาที่ประกอบด้วยสมุนไพร 21 ชนิด ซึ่งแพทย์แผนไทยใช้เพื่อรักษาไข้สูง ส่วนประกอบของตำรับยาหม้อห้ารากถูกแบ่งตามหน้าที่ออกเป็น 3 กลุ่ม คือ กลุ่มสมุนไพรหลัก (MA) รักษาอาการหลัก เช่น ไข้สูง แผลในปาก และอาการกระหายน้ำ กลุ่มสมุนไพรรอง (CMA) รักษาอาการรอง เช่น ช่วยระบายและลดพิษไข้ กลุ่มสมุนไพรประกอบ (SMA) ช่วยบำรุงหัวใจ วัตถุประสงค์ของการวิจัยนี้ คือ เพื่อพิสูจน์ทฤษฎีการตั้งตำรับยาแผนไทยตามหลักการแพทย์แผนไทย ด้วยกระบวนการทางวิทยาศาสตร์ โดยการศึกษาเอกลักษณ์ทางเคมี ฤทธิ์ทางเภสัชวิทยา และความเป็นพิษของสูตรตำรับต่าง ๆ จากการลดจำนวนสมุนไพรในแต่ละกลุ่มเปรียบเทียบกับตำรับดั้งเดิม (หม้อห้าราก) การควบคุมคุณภาพวัตถุดิบสมุนไพรด้วยวิธีการทดสอบตามมาตรฐานตามตำรายาไทย (Thai Herbal Pharmacopoeia) หรือแหล่งอ้างอิงอื่น ๆ เพื่อกำหนดค่าปริมาณสารสกัด โดยสูตรตำรับทั้ง 91 ตำรับ และตำรับดั้งเดิม (หม้อห้าราก) ถูกนำมาสกัดด้วยวิธีการหมักด้วยเอทานอลความเข้มข้น 70% และสกัดด้วยวิธีการต้มด้วยน้ำ จากนั้นนำสารสกัดไปทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบ ด้วยวิธีการยับยั้งไนตริกออกไซด์ (NO) และทดสอบเป็นพิษด้วยวิธี MTT ในเซลล์ RAW 264.7 ที่ถูกเหนี่ยวนำด้วย LPS ทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธีการกำจัดอนุมูลอิสระไนตริกออกไซด์ (NO) ซึ่งใช้ Griess-reagent วัดการยับยั้ง NO และวิธีกำจัดอนุมูลอิสระซุปเปอร์ออกไซด์ (O2•–) ด้วย riboflavin-light-NBT system และศึกษาลักษณะและระบุเอกลักษณ์ทางเคมีด้วยวิธี HPLC

จากการศึกษาพบว่า สมุนไพร 18 ชนิดผ่านเกณฑ์มาตรฐาน ยกเว้นมะกา (B. ovata) และ คูน (C. fistula) ในขณะที่ปริมาณสารสกัดเอทานอลของสะเดา (A. indica) จาก 15 แหล่ง มีค่าเฉลี่ยเท่ากับ 4.30 ± 1.14% และปริมาณสารสกัดน้ำมีค่าเท่ากับ 10.57 ± 2.65% วัตถุดิบพืชสมุนไพรจากแหล่งที่มีปริมาณสารสกัดที่สูงกว่าค่าเฉลี่ยหรือเป็นไปตามข้อกำหนดมาตรฐานจะได้รับการคัดเลือกเพื่อใช้ ในการศึกษาครั้งนี้ การศึกษาลักษณะและระบุเอกลักษณ์ทางเคมีด้วยวิธี HPLC พบว่าสามารถระบุพีคได้มากที่สุดที่ความยาวคลื่น 254 และ 280 นาโนเมตร โดยสารสกัดเอทานอลสามารถระบุสารสำคัญได้ 13 ชนิด ในโครมาโตแกรม ได้แก่ chebulic acid, gallic acid, protocatechuic acid, bergenin, chlorogenic acid, chebulanin, corilagin, chebulagic acid, ellagic acid, resveratrol, rhein, loureirin A และ perforatic acid ในขณะที่สารสกัดน้ำสามารถระบุสารสำคัญได้ 11 ชนิด ได้แก่ chebulic acid, gallic acid, protocatechuic acid, bergenin, chebulanin, corilagin, chebulagic acid, ellagic acid, rhein, loureirin A และ perforatic acid โดยการศึกษาครั้งนี้ได้แยกสาร perforatic acid จากรากของคนทา (Harrisonia perforata) และทำให้บริสุทธิ์ อีกทั้งสารเหล่านี้จะถูกกำหนดเป็นสารบ่งชี้ทางเคมี (marker) ในโครมาโตแกรมของตำรับยาทั้ง 92 ตำรับ เพื่อศึกษาเชิงคุณภาพและเชิงปริมาณ

การศึกษาครั้งนี้แสดงให้เห็นว่าสูตรที่มีเฉพาะยาหลัก (MA) ทำให้เพิ่มฤทธิ์ต้านการอักเสบ เมื่อเทียบกับตำรับดั้งเดิม (หม้อห้าราก: MHR) และมีฤทธิ์ต้านการอักเสบที่สูงกว่าสูตรที่มีเฉพาะยารอง (CMA) หรือยาประกอบ (SMA) การตัดกลุ่มของยารอง หรือยาประกอบ ออก ไม่ได้ลดฤทธิ์ต้านการอักเสบเมื่อเทียบกับตำรับดั้งเดิม อย่างไรก็ตามสูตรที่มีเฉพาะยารอง หรือยาประกอบ แสดงฤทธิ์ต้านการอักเสบ ที่ต่ำกว่าตำรับดั้งเดิม อย่างมีนัยสำคัญ

การตัดกลุ่มยารอง ออก ส่งผลให้ลดฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับตำรับดั้งเดิม ขณะที่สูตรที่มีเฉพาะยารอง ทำให้เพิ่มฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระเมื่อเทียบกับตำรับดั้งเดิม และมีฤทธิ์ที่สูงกว่าสูตรที่มีเฉพาะยาหลัก หรือยาประกอบ นอกจากนี้การตัดกลุ่มยาประกอบ ออก หรือใช้สูตรที่มีเฉพาะยาประกอบ ไม่ได้เพิ่มฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระให้ยาหลักที่เป็นสารสกัดเอทานอล แต่ก็ไม่ได้ลดฤทธิ์ ต้านอนุมูลอิสระเมื่อเทียบกับยาหลักที่เป็นสารสกัดน้ำ

การศึกษาความเป็นพิษ พบว่าการตัดกลุ่มยารอง ออก ส่งผลให้การรอดชีวิตของเซลล์สูงขึ้น เมื่อเทียบกับตำรับดั้งเดิม ส่วนการตัดกลุ่มยาประกอบ ออก ส่งผลให้การรอดชีวิตของเซลล์สูงกว่าตำรับดั้งเดิม ขณะที่สูตรที่มีเฉพาะยารอง หรือยาประกอบ ทำให้การรอดชีวิตของเซลล์ไม่แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญจากตำรับดั้งเดิม สูตรที่มีเฉพาะยาหลักทำให้การรอดชีวิตของเซลล์ต่ำกว่าตำรับดั้งเดิม แต่การรอดชีวิตของเซลล์ไม่ได้แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญกับ ยารอง หรือยาประกอบ

การลดจำนวนสมุนไพรในกลุ่มยาประกอบ ส่งผลให้ฤทธิ์ต้านการอักเสบลดลงอย่างมีนัยสำคัญ เมื่อเทียบกับตำรับดั้งเดิม แต่ไม่ได้ลดการรอดชีวิตของเซลล์อย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับตำรับดั้งเดิม นอกจากนี้การลดจำนวนสมุนไพรในยาประกอบ แสดงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระระดับปานกลาง โดยไม่ได้ลดฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับตำรับดั้งเดิม ทั้งการกำจัดอนุมูลอิสระ NO และ O2•–

การลดจำนวนสมุนไพรในกลุ่มย่อยของยารองจำนวนมากขึ้น นำไปสู่การเพิ่มฤทธิ์ต้านการอักเสบเมื่อเทียบกับตำรับดั้งเดิม แต่ไม่ได้ลดการรอดชีวิตของเซลล์ลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับตำรับดั้งเดิมนอกจากนี้การลดจำนวนสมุนไพรในกลุ่มย่อยของยารองจำนวนมากขึ้น นำไปสู่การลดฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ เมื่อเทียบกับตำรับดั้งเดิม ทั้งการกำจัดอนุมูลอิสระ NO และ O2•–

การลดจำนวนสมุนไพรในกลุ่มย่อยของยาหลัก อาจไม่ส่งผลต่อฤทธิ์ต้านการอักเสบ แต่อาจช่วยลดความเป็นพิษ การตัดกลุ่มย่อยที่รักษาไข้เพื่อเสมหะและไข้เพื่อลม หรือกลุ่มย่อยที่รักษาไข้เพื่อกำเดาและไข้เพื่อโลหิต ออก ไม่ได้ลดฤทธิ์ต้านการอักเสบอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับยาหลัก แต่ยังอาจช่วยลดความเป็นพิษของยาหลัก ในทางตรงกันข้ามการตัดกลุ่มย่อยที่รักษาไข้เพื่อดีส่งผลให้ลดฤทธิ์ต้านการอักเสบอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับยาหลัก นอกจากนี้การตัดสมุนไพรในทั้งสามกลุ่มย่อยออก คงเหลือแต่กลุ่มยาลดพิษไข้ ไม่ได้ลดฤทธิ์ต้านการอักเสบอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับยาหลัก แต่กลับเพิ่มความเป็นพิษสูงขึ้น

การลดจำนวนสมุนไพรในกลุ่มย่อยยาลดพิษไข้ (FG33) แสดงให้เห็นว่าการตัดมะเดื่อชุมพร (F. racemosa) และย่านาง (T. triandra) ออก ส่งผลให้ฤทธิ์ต้านการอักเสบลดลง เมื่อเทียบกับ FG33 และยังลดความเป็นพิษลง ในทางตรงกันข้าม การตัดชิงชี่ (C. micracantha), เท้ายายม่อม (C. indicum) และคนทา (H. perforata) ส่งผลให้ฤทธิ์ต้านการอักเสบเพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับ FG33 แต่กลับช่วยลดความเป็นพิษลง ขณะที่สมุนไพรเดี่ยว มะเดื่อชุมพร (F. racemosa) และย่านาง (T. triandra) มีฤทธิ์ ต้านการอักเสบที่สูงไม่แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับ FG33 อย่างไรก็ตามย่านางแสดงความเป็นพิษสูง สุดท้ายนี้การลดจำนวนสมุนไพรในกลุ่มย่อยของยาหลักจำนวนมากขึ้น ทั้งในสารสกัดเอทานอลและน้ำ ไม่ได้ลดฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระเมื่อเทียบกับยาหลัก ซึ่งแสดงฤทธิ์กำจัดอนุมูลอิสระ NO ระดับปานกลาง แต่แสดงฤทธิ์กำจัดอนุมูลอิสระ O2•– ในระดับสูง

ผลการศึกษาพบว่า resveratrol ซึ่งเป็นสารบ่งชี้ทางเคมี มีฤทธิ์ต้านการอักเสบสูงสุด มีค่า IC50 เท่ากับ 17.83 ± 0.70 µg/mL รองลงมาคือ rhein, ellagic acid และ loureirin A ที่ค่า IC50 เท่ากับ 19.68 ± 0.09 µg/mL, 42.13 ± 1.87 และ 72.42 ± 1.40 µg/mL ตามลำดับ ซึ่งมีประสิทธิภาพสูงกว่าindomethacin (สารมาตรฐาน) ที่มีค่า IC50 เท่ากับ 73.42 ± 0.48 µg/mL ในขณะที่ bergenin, chebulagic acid, chebulanin, chebulic acid, chlorogenic acid, corilagin, gallic acid, perforatic acid และ protocatechuic acid ไม่สามารถวัดค่า IC50 ได้ (IC50 > 100 µg/mL)

การวิเคราะห์ความสัมพันธ์เชิงเส้นโดยใช้ Principal Component Analysis (PCA) พบว่าฤทธิ์ต้านการอักเสบมีความสัมพันธ์ตรงกันข้ามกับการรอดชีวิตของเซลล์ ในขณะที่ฤทธิ์กำจัดอนุมูลอิสระไนตริกออกไซด์มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับกำจัดอนุมูลอิสระซุปเปอร์ออกไซด์ อย่างไรก็ตาม ฤทธิ์กำจัดอนุมูลอิสระไนตริกออกไซด์หรือซุปเปอร์ออกไซด์ไม่มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญกับฤทธิ์ต้านการอักเสบหรือการรอดชีวิตของเซลล์

การวิเคราะห์ความสัมพันธ์ของ Pearson’s พบว่าสารบ่งชี้ทางเคมีส่วนใหญ่ของยาหลัก (MA) กับยารอง (CMA) หรือยาประกอบ (SMA) มีความสัมพันธ์เชิงลบ ในขณะที่สารบ่งชี้ทางเคมีส่วนใหญ่ของยาหลัก มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับฤทธิ์ต้านการอักเสบ ซึ่งแสดงให้เห็นว่าฤทธิ์ต้านการอักเสบเพิ่มขึ้นเมื่อพื้นที่ใต้กราฟของสารบ่งชี้ทางเคมีเพิ่มขึ้น ในทางตรงกันข้าม สารบ่งชี้ทางเคมีส่วนใหญ่ของยาหลักมีความสัมพันธ์เชิงลบกับการรอดชีวิตของเซลล์

นอกจากนี้สารบ่งชี้ทางเคมีส่วนใหญ่ของยารอง หรือยาประกอบ มีความสัมพันธ์เชิงลบกับฤทธิ์ต้านการอักเสบ ในทางตรงกันข้าม สารบ่งชี้ทางเคมีส่วนใหญ่ของยารองหรือยาประกอบมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ ซึ่งแสดงให้เห็นว่าฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระเพิ่มขึ้นเมื่อพื้นที่ใต้กราฟของสารบ่งชี้ทางเคมีเพิ่มขึ้น

การศึกษาครั้งนี้แสดงให้เห็นว่า ยาหลักมีผลโดยตรงต่อฤทธิ์ต้านการอักเสบ การลดจำนวนสมุนไพรในยารองและยาประกอบ ไม่ได้ลดฤทธิ์ต้านการอักเสบเมื่อเทียบกับตำรับดั้งเดิม การลดสมุนไพรบางชนิดในยาหลักอาจไม่ส่งผลต่อฤทธิ์ต้านการอักเสบ ในทางกลับกันการลดสมุนไพรบางชนิดในยาหลัก อาจลดความเป็นพิษและมีฤทธิ์ต้านการอักเสบที่สูงกว่าตำรับดั้งเดิม ทั้งนี้สมุนไพรในยารอง และยาประกอบไม่ได้เพียงแค่รักษาอาการรองและบำรุงร่างกาย แต่ยังอาจลดความเป็นพิษของยาหลักได้ การศึกษานี้แสดงให้เห็นถึงความสำเร็จในการพิสูจน์ทางวิทยาศาสตร์ของทฤษฎีการตั้งตำรับยาแผนไทย และเป็นต้นแบบสำหรับการศึกษาตำรับยาอื่น ๆ ต่อไป