Screening of Bacillus sp. Strains Collected from Lower Northeastern Region of Thailand to Assess Their Potential in Controlling Dirty Panicle Rice Disease in Fragrant Rice Cultivar Khao Dawk Mali 105

Abstract

Dirty Panicle Disease presents a major constraint to rice production, causing yield losses of up to 85% during severe outbreaks, with the most noticeable symptoms emerging at harvest. Due to the limitations and environmental concerns of chemical control, biological methods have gained prominence as sustainable and eco-friendly alternatives. Recent research has focused on soil microorganisms, particularly Bacillus sp., which are known to produce antimicrobial compounds and hydrolytic enzymes that inhibit plant pathogens. This study aimed to identify native Bacillus sp. strains capable of inhibiting the fungal pathogens responsible for Dirty Panicle Disease in Khao Dawk Mali 105 rice. The research comprised five sequential experiments: The first experiment aimed to assess the pathogenicity of fungi causing Dirty Panicle Disease. This experiment evaluated disease severity and seed symptom expression caused by six fungal pathogens (Curvularia sp., Cercospora sp., Bipolaris sp., Fusarium sp., Trichoconis sp., and Sarocladium sp.) using a Completely Randomized Design (CRD) with 9 treatments and 4 replications. Seed inoculation followed ISTA standards, and symptom progression was observed at 12, 24, 48, 72, 120, and 168 hours post-inoculation. Catalase enzyme activity served as a biochemical indicator of seed deterioration. Although no external seed coat symptoms (disease level 0) were detected, internal infections significantly reduced germination. Curvularia sp. caused total inhibition (0% germination), marking it as the most aggressive, while Sarocladium sp. had the least impact (68% germination). Catalase activity significantly varied among fungi, reflecting differences in pathogenic aggressiveness. The second experiment aimed to evaluate the Bacillus sp. for antifungal activity against Dirty Panicle pathogens. Ten Bacillus isolates (UBU1, UBW2, BRCR3, BRBD12, SKKH3, SKNK4, SKKK4, SK-NK3, SKY7, and SRSHP19) were tested in cell suspension (CS) and cell-free culture filtrate (CFF) forms using a 10×6×2 factorial CRD design (120 treatments, 4 replications). Antagonistic activity was assessed using the dual culture method. The CFF of isolates SKKH3 and BRBD12 fully inhibited fungal spore germination (100%). Overall, CFF treatments were more effective than CS. PCR analysis showed that B. siamensis UBU1, BRBD12, SKKH3, SKY7, and SKKK4 carried four key antibiotic synthesis genes (srfA, ituA, bacD, and bmyA), identifying them as strong biocontrol candidates. The third experiment aimed to investigate the spore germination inhibition by selected Bacillus sp. Five high-performing isolates from Experiment 2 (B. siamensis UBU1, BRBD12, SKKH3, SKKK4, and B. Cereus SRSHP19) were tested for spore inhibition of the six fungal pathogens using a 5×6 factorial in CRD (30 treatments, 4 replications; 100 spores/treatment). Slide cultures were observed at 15 hours under a microscope. Results showed significant treatment effects. B. siamensis SKKH3 and SKKK4 exhibited the highest efficacy, completely suppressing spore germination of Curvularia sp. (100%). The fourth experiment aimed to assess the effects of Bacillus sp. on germination and seedling vigor of Khao Dawk Mali 105. To assess compatibility with seed physiology, the same five Bacillus isolates were evaluated for their effects on germination and early seedling growth in a CRD with 6 treatments and 4 replications. Surface-sterilized seeds were coated with the isolates and incubated under controlled conditions. No significant differences were observed in germination rates or germination index at 7 and 14 days. However, seedlings treated with B. siamensis SKKH3 and SKKK4 showed significantly higher vigor indices, suggesting growth-promoting effects. Importantly, none of the treatments negatively impacted germination, confirming their suitability for seed application. The fifth experiment aimed to investigate the efficacy of Bacillus sp. in reducing Dirty Panicle Disease under greenhouse conditions. This experiment tested the efficacy of the five Bacillus isolates in suppressing Dirty Panicle Disease in Khao Dawk Mali 105 under greenhouse conditions. A CRD with 38 treatments and 4 replications was used. Treatments included individual Bacillus applications with fungal inoculation, a mixed fungal inoculum, a chemical fungicide, and a commercial Bacillus product, alongside a non-inoculated control. All five Bacillus isolates significantly reduced disease incidence compared to the untreated control. They also improved 1,000-grain weight, weight of unbroken grains, and total yield per plot. These parameters were significantly better than the distilled water control but not significantly different from chemical or commercial Bacillus-based treatments.

This study demonstrates that native Bacillus sp., particularly B. siamensis SKKH3 and SKKK4, exhibit strong potential for suppressing fungal pathogens associated with Dirty Panicle Disease. The recommendation is to develop the product into a bioformulation for actual commercial use and to find ways to create a formulation with high stability and long shelf life, offering a safe and sustainable alternative for the production of Khao Dawk Mali 105 rice under varying environmental conditions across different regions.

โรคเมล็ดด่างในข้าว (Dirty Panicle Disease) จัดเป็นปัญหาสำคัญในการผลิตข้าว หากเกิดการระบาดรุนแรงส่งผลทำให้ผลผลิตเสียหายมาก อาการเมล็ดด่างจะปรากฏเด่นชัดในช่วงเก็บเกี่ยวและส่งผลให้ผลผลิตลดลงถึงร้อยละ 85 การควบคุมโรคโดยชีววิธีจึงเข้ามามีบทบาทมากขึ้น เพื่อลดปัญหาการใช้สารเคมีและเป็นการรักษาความสมดุลของธรรมชาติ ปัจจุบันมีการศึกษานำเชื้อจุลินทรีย์ในดินมาใช้ประโยชน์ พบว่าเชื้อแบคทีเรียในกลุ่ม Bacillus sp. มีความสามารถในการผลิตสารต้านจุลชีพและเอนไซม์ที่สามารถยับยั้งเชื้อสาเหตุโรคพืชได้ รวมถึงส่งเสริมการเจริญเติบโตของพืช ดังนั้นการศึกษาจึงมีวัตถุประสงค์เพื่อคัดเลือกเชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. จากท้องถิ่นที่สามารถยับยั้งการเข้าทำลายของโรคเมล็ดด่างในข้าวพันธุ์ขาวดอกมะลิ 105 โดยดำเนินการวิจัยเป็น 5 การทดลอง คือ การทดลองที่ 1 การทดสอบการก่อโรคของเชื้อราสาเหตุโรคเมล็ดด่างในข้าวพันธุ์ขาวดอกมะลิ 105 เพื่อประเมินการก่อโรคและอาการด่างบนเมล็ดข้าวพันธุ์ขาวดอกมะลิ 105 ด้วยแผนการทดลองแบบ Completely Randomized Design จำนวน 4 ซ้ำ 9 กรรมวิธี โดยทำการทดสอบความสามารถในการก่อให้เกิดโรคเมล็ดด่างในข้าวจากเชื้อรา โดยใช้วิธี seed inoculation assay แล้วประเมินอาการของโรคที่เกิดขึ้นที่ 12, 24, 48, 72, 120 และ 168 ชั่วโมงภายหลังจากการปลูกเชื้อ ตามหลักการของ International Seed Testing Association (ISTA) และตรวจสอบคุณสมบัติทางชีวเคมีของกิจกรรมเอนไซม์คาตาเลสต่อการเสื่อมคุณภาพเมล็ดพันธุ์ ผลการศึกษาพบว่า อาการบนเปลือกเมล็ดข้าวซึ่งไม่มีความแตกต่างกันทางสถิติ แต่พบอาการภายในเมล็ดซึ่งส่งผลต่อการงอกของเมล็ดข้าวที่มีความแตกต่างทางสถิติอย่างมีนัยสำคัญยิ่ง โดยเชื้อ Curvularia sp. มีความรุนแรงสูงสุดต่อเมล็ดข้าวที่ได้รับเชื้อทำให้เมล็ดไม่งอก 100% แต่เมล็ดข้าวที่รับเชื้อรา Sarocladium sp. จะได้รับผลกระทบน้อยที่สุด จากการตรวจวัดกิจกรรมเอนไซม์คาตาเลส เมล็ดข้าวที่ได้รับเชื้อรา Curvularia sp., Cercospora sp., Bipolaris sp., Fusarium sp., Trichoconis sp., Sarocladium sp. และได้รับเชื้อราร่วมกัน 6 ชนิด มีกิจกรรมเอนไซม์คาตาเลสแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ บ่งชี้ว่าเชื้อราสาเหตุมีความรุนแรงต่อการก่อโรคได้แตกต่างกัน การทดลองที่ 2 การทดสอบประสิทธิภาพสารกรองเชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. ต่อการยับยั้งเชื้อราสาเหตุโรคเมล็ดด่างข้าว เพื่อคัดเลือกสายพันธุ์เชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. ที่มีประสิทธิภาพในการยับยั้งเชื้อราสาเหตุโรคเมล็ดด่าง และประเมินประสิทธิภาพของสารกรอง ด้วยแผนการทดลองแบบ 10x6x2 Factorial in Completely Randomized Design มี 120 กลุ่มทดลอง ๆ ละ 4 ซ้ำ ปัจจัย A คือเชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. จำนวน 10 ไอโซเลต ปัจจัย B คือลักษณะเชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. 2 รูปแบบ และปัจจัย C คือเชื้อราสาเหตุโรคเมล็ดด่าง 6 ชนิด โดยเลี้ยงเชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. จำนวน 10 ไอโซเลต ได้แก่ Bacillus UBU1, Bacillus UBW2, Bacillus BRCR3, Bacillus BRBD12, Bacillus SKKH3, Bacillus SKNK4, Bacillus SKKK4, Bacillus SKNK3, Bacillus SKY7 และ Bacillus SRSHP19 เตรียมให้อยู่ในรูป cell suspension (CS) และ cell-free culture filtrate (CFF) สำหรับการยับยั้งการเจริญของเส้นใยเชื้อราสาเหตุโรคเมล็ดด่างข้าว ด้วยวิธี Dual culture method และตรวจสอบยีนที่กำหนดการสร้างสารปฏิชีวนะ คัดเลือกเชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. ที่ยับยั้งเชื้อราสาเหตุโรคเมล็ดด่างข้าวที่ดีที่สุด ผลการทดลองพบว่า รูปแบบเซลล์ CFF ของเชื้อแบคทีเรีย Bacillus SKKH3 และ BRBD12 สามารถยับยั้งการงอกของสปอร์ได้ถึง 100 เปอร์เซ็นต์ โดยรูปแบบเซลล์ CFF ของเชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. มีประสิทธิภาพในการยับยั้งการงอกของสปอร์เชื้อราได้ดีกว่ารูปแบบเซลล์ CS และเมื่อนำเชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. ทั้ง 10 ไอโซเลต ทำการตรวจหายีนที่กำหนดการสร้างสารปฏิชีวนะ 4 ยีน ได้แก่ ยีน srfA, ituA, bacD และ bmyA พบว่ามีเชื้อแบคทีเรีย B. siamensis UBU1, B. siamensis BRBD12, B. siamensis SKKH3, B. siamensis SKY7 และ B. siamensis SKKK4 มียีนสร้างสารปฏิชีวนะทั้ง 4 ยีน ที่แตกต่างจากไอโซเลตอื่น การทดลองที่ 3 การทดสอบประสิทธิภาพเชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. ในการยับยั้งการงอกสปอร์ของเชื้อราสาเหตุโรคเมล็ดด่างข้าว เพื่อคัดเลือกเชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. ไอโซเลตที่มีประสิทธิภาพในการยับยั้งการงอกสปอร์ของเชื้อราสาเหตุโรคเมล็ดด่างข้าว จากการทดลองที่ 2 จำนวน 5 ไอโซเลต คือ B. siamensis UBU1, B. siamensis BRBD12, B. siamensis SKKH3, B. siamensis SKKK4 และ B. cereus SRSHP19 ด้วยแผนการทดลองแบบ 5x6 Factorial in Completely Randomized Design มี 30 กลุ่มทดลอง ๆ ละ 4 ซ้ำ ๆ ละ 100 สปอร์ ปัจจัย A คือเชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. 5 ไอโซเลต ปัจจัย B คือเชื้อราสาเหตุโรคเมล็ดด่าง 6 ชนิด ได้แก่ Trichoconis sp., Sarocladium sp., Cercospora sp., Bipolaris sp., Curvularia sp. และ Fusarium sp. ดำเนินการทดลองโดยใช้เทคนิค slide culture ตรวจผลที่ 15 ชั่วโมงหลังทดสอบ และตรวจนับการงอกของสปอร์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ ผลการทดลองพบว่าเชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. สามารถยับยั้งการงอกของสปอร์เชื้อราสาเหตุโรคเมล็ดด่างข้าวได้แตกต่างกันทางสถิติอย่างมีนัยสำคัญ คือเชื้อแบคทีเรีย B. siamensis SKKK4 และ B. siamensis SKKH3 สามารถยับยั้งการงอกสปอร์ของเชื้อราสาเหตุทั้ง 6 ชนิดได้ดีที่สุด นอกจากนี้เชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. สามารถยับยั้งการงอกสปอร์ของเชื้อราชนิด Curvularia sp. ได้ดีที่สุด การทดลองที่ 4 การทดสอบประสิทธิภาพของเชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. ต่อการงอกของเมล็ดข้าวพันธุ์ขาวดอกมะลิ 105 เพื่อตรวจหาคุณสมบัติของเชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. จำนวน 5 ไอโซเลต ที่มีผลต่อการงอกและการเจริญเติบโตของต้นกล้าข้าวขาวดอกมะลิ 105 ด้วยแผนการทดลองแบบ Completely Randomized Design จำนวน 4 ซ้ำ 6 กรรมวิธี คือเมล็ดข้าวพันธุ์ขาวดอกมะลิ 105 ที่ผ่านการฆ่าเชื้อ และนำมาคลุกกับเชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. แต่ละไอโซเลตจำนวน 5 ไอโซเลต และกรรมวิธีควบคุมไม่คลุกเชื้อ ผลการทดลองพบว่า การงอกของเมล็ดข้าว และดัชนีการงอก ที่อายุ 7 และ 14 วันหลังการเพาะเมล็ด ไม่มีความแตกต่างกันทางสถิติเมื่อเปรียบเทียบกับกรรมวิธีควบคุม และเมื่อเมล็ดข้าวได้รับเชื้อแบคทีเรีย B. cereus SRSHP19, B. siamensis SKKH3, B. siamensis BRBD12 และ B. siamensis SKKK4 มีพลังงานในการงอกและอัตราเร็วในการงอกไม่แตกต่างทางสถิติกับกรรมวิธีควบคุม ส่วนดัชนีความแข็งแรงของต้นกล้า B. siamensis SKKK4 และ B. siamensis SKKH3 มีดัชนีความแข็งแรงมากกว่ากรรมวิธีควบคุมอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ ซึ่งบ่งชี้ให้เห็นว่าเชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. ไม่มีผลกระทบต่อการงอกของเมล็ดข้าวพันธุ์ขาวดอกมะลิ 105 การทดลองที่ 5 การทดสอบประสิทธิภาพของเชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. ในการลดโรคเมล็ดด่างข้าว ในสภาพเรือนทดลอง เพื่อนำผลประสิทธิภาพเชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. จำนวน 5 ไอโซเลต ในการลดปริมาณการเกิดโรคเมล็ดด่างข้าวพันธุ์ขาวดอกมะลิ 105 ในสภาพเรือนทดลอง ด้วยแผนการทดลองแบบ Completely Randomized Design จำนวน 4 ซ้ำ 38 กรรมวิธี ประกอบด้วยเชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. จำนวน 5 ไอโซเลต ที่ร่วมกับการฉีดพ่นเชื้อราสาเหตุโรคเมล็ดด่างจำนวน 6 ชนิด และพ่นเชื้อราสาเหตุที่รวมมาจากเชื้อทั้ง 6 ชนิด และกรรมวิธีควบคุมประกอบด้วย กรรมวิธีไม่คลุกเชื้อราสาเหตุโรค กรรมวิธีที่ใช้สารเคมี และกรรมวิธีที่ใช้ B. subtilis ที่ผลิตเพื่อการค้า ผลการทดลองพบว่าเชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. ทั้ง 5 ไอโซเลตสามารถลดเปอร์เซ็นต์การเกิดโรคเมล็ดด่างบนเมล็ดข้าวพันธุ์ขาวดอกมะลิ 105 ได้แตกต่างกันทางสถิติอย่างมีนัยสำคัญยิ่งเมื่อเทียบกับกรรมวิธีควบคุมทั้ง 3 กรรมวิธี จึงทำให้น้ำหนัก 1000 เมล็ด น้ำหนักเมล็ดข้าวดี และผลผลิตต่อหน่วยทดลองแตกต่างกันทางสถิติอย่างมีนัยสำคัญยิ่งกับกรรมวิธีควบคุมที่ไม่ได้คลุกเชื้อ แต่ไม่แตกต่างกับกรรมวิธีควบคุมที่ใช้สารเคมีและกรรมวิธีควบคุมที่ใช้ Bacillus sp. ที่ผลิตเพื่อการค้า

การศึกษาครั้งนี้สรุปได้ว่าเชื้อแบคทีเรีย Bacillus sp. มีศักยภาพสูงในการควบคุมเชื้อราที่ก่อให้เกิดโรคเมล็ดด่างในข้าว โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เชื้อแบคทีเรีย B. siamensis ไอโซเลต SKKK4 และ SKKH3 ข้อเสนอแนะควรพัฒนาเป็นชีวภัณฑ์สู่การใช้จริงในเชิงพาณิชย์ และหาแนวทางในการสร้างสูตรให้มีความคงตัวสูง และสามารถเก็บรักษาได้นาน ให้เป็นทางเลือกที่ปลอดภัย และยั่งยืนต่อการผลิตข้าวพันธุ์ขาวดอกมะลิ 105 ภายใต้สภาพแวดล้อมที่แตกต่างกันในแต่ละพื้นที่ต่อไป