Plant esterase as indicator for organophosphate and carbamate pesticide residues detection

Abstract

Carboxylesterase (CES: EC 3.1.1.1) as Esterases B (Est-B), is an enzyme which inhibited by Organophosphate (OPs) and Carbamate (CAs) groups. In this study, the extractions method and enzyme activity of CES were investigated. Five legume seeds, black gram bean (Phaseolus mungo L.), mung bean (Vigna radiata (L.) Wilczek), red kidney bean (Phaseolus vulgaris L.), red bean (Vigna umbellata (Thunb.) Ohwi & Ohashi) and soy bean (Glycine max L.) were extracted by phosphate buffer (0.1M, pH 7). After precipitation with 60% of ammonium sulfate and dialysis, the partially purified extracted enzymes were reacted with specificity substrate α-naphthyl for determination of CES activity and specific activity. The partially purified extracted enzymes of black gram showed higher specific activity than mung bean, red kidney bean red, bean and soy bean with significant differences (p<0.05) (3.96±0.26 1.51±0.10 1.40±0.12 1.29±0.08 and 0.70±0.04 U/mg, respectively).

The effect of OPs and CAs pesticides (0.001 – 3.0 µg/ml) on the inhibition of partially purified extracted enzymes were investigated. It was found that the partially purified extracted enzymes of black gram bean showed higher the inhibition ratio (I%) than mung bean and red bean with significant differences (p<0.05). It means, partially purified extracted enzymes of black gram bean was more sensitive for OPs and CAs than mung bean and red bean. At the same concentration of OPs and CAs the I(%) of OPs was higher than CAs. The limits of detection (LOD) of partially purified extracted enzymes of black gram bean by the enzyme inhibition assay were studied. Lettuces and apples were extracted by Modified QuEChERS. After that, the extract samples were determined for OPs and CAs by enzyme inhibition assay using partially purified extracted enzymes of black gram bean. At the concentration of 0.002 and 0.01 mg/kg of OPs and CAs, the results of IC10 as LOD of enzyme inhibition assay showed the values of 7, 9, 8 and 10 respectively. During 12-45 day storages at 4oC for 60 days, it was found that the specific activity of enzymes were decreased with no significant differences, more ever the specific activity of enzymes were decreased to 31.7% at the end of storage.

The sensitivity of partially purified extracted enzymes of black gram bean compared with commercial enzyme of test kit on OPs and CAs for 50 samples including, chinese cabbage, lettuce, cabbage, coriander, culantro, chili, sweet basil, yard long bean and cucumber was determined. The sensitivity of black gram bean enzyme was determined accordance with the method of commercials test kit. The 46 samples (92.0%) showed the results as safe level and 4 samples (8.0%) showed unsafe levels consist of culantro 3 samples (6.0%), coriander 1 sample (2.0%). More advantage, partially purified extracted enzymes of black gram bean could react at room temperature.

The efficiency of the enzyme inhibition assay compared with the classical method (GC-FPD+ and HPLC-FLD) for determination of pesticide residues in 50 vegetables was investigated. For the enzyme inhibition assay with partially purified extracted enzymes of black gram bean, 11 samples (22.0%) were detected for pesticide residues and 17 samples (34.0%) detected by the classical method (GC-FPD+ and HPLC-FLD. The testing performance of the enzyme inhibition assay showed 100.0% specificity and 90.0% accuracy. All of testing performances were acceptable (ranged from 80–100%), except sensitivity was 70.5%. More ever, 5 samples from enzyme inhibition assay had not accordance with the classical method, includes of 2 samples sweet basil, coriander, chili, and cucumber.

เอนไซม์คาร์บอกซิลเอสเตอร์เรส (Carboxylesterase: CES; EC 3.1.1.1) เป็นเอนไซม์เอสเตอร์เรส B (Esterases B; Est-B) ที่มีคุณสมบัติถูกยับยั้งการทำงานจากยาฆ่าแมลงกลุ่มออร์กาโนฟอสเฟต (OPs) และกลุ่มคาร์บาเมต (CAs) งานวิจัยนี้ได้ศึกษาเอนไซม์คาร์บอกซิลเอสเตอร์เรสจากถั่ว 5 ชนิด คือ ถั่วดำ (Phaseolus mungo L.) ถั่วแดง (Vigna umbellata (Thunb.) Ohwi & Ohashi) ถั่วเขียว (Vigna radiata (L.) Wilczek) ถั่วแดงหลวง (Phaseolus vulgaris L.) และถั่วเหลือง (Glycine max L.) จากการศึกษาสกัดตัวอย่าง 12 กรัม ในสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (0.1 M, pH 7) และทำบริสุทธิ์บางส่วนโดยการตกตะกอนเอนไซม์ด้วยเกลือแอมโนเนียมซัลเฟต ความเข้มข้นร้อยละ 60 และไดอะไลซีส นำมาศึกษากิจกรรมเอนไซม์และค่าแอกติวิตีจำเพาะเอนไซม์บริสุทธิ์บางส่วนโดยใช้ α -naphthyl acetate ซึ่งเป็นสารตั้งต้นที่มีความจำเพาะ พบค่าแอคติวิตีจำเพาะเอนไซม์คาร์บอกซิลเอสเตอร์เรสบริสุทธิ์บางส่วนของถั่วดำมีค่าสูงสุด เมื่อเทียบกับถั่วชนิดอื่นอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p<0.05) รองลงมาคือ ถั่วเขียว ถั่วแดงหลวง ถั่วแดง และถั่วเหลือง โดยมีค่า 3.96±0.26 1.51±0.10 1.40±0.12 1.29±0.08 และ 0.70±0.04 U/mg ตามลำดับ

การศึกษาผลของยาฆ่าแมลงกลุ่ม OPs และกลุ่ม CAs ที่ความเข้มข้น 0.001 – 3.0 µg/ml ต่อการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์คาร์บอกซิลเอสเตอร์เรสบริสุทธิ์บางส่วน พบค่าร้อยละของการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ (I(%)) ของถั่วดำมีค่าสูงกว่า ถั่วเขียว และถั่วแดง แสดงถึงเอนไซม์จากถั่วดำมีความไวต่อยาฆ่าแมลงสูงกว่าถั่วเขียวและถั่วแดง และพบว่าที่ความเข้มข้นของยาฆ่าแมลงเท่ากัน ค่า I(%) ของสารกลุ่ม OPs จะมีค่าสูงกว่าสารกลุ่ม CAs นอกจากนี้การศึกษาขีดจำกัดของการตรวจวิเคราะห์ยาฆ่าแมลง (LOD; ค่า IC10) ของเอนไซม์คาร์บอกซิลเอสเตอร์เรสบริสุทธิ์บางส่วนจากถั่วดำในตัวอย่างแอปเปิ้ลและผักกาดหอมที่สกัดด้วยวิธี Modified QuEChERS ที่ความเข้มข้นของยาฆ่าแมลงมาตรฐานกลุ่ม OPs และกลุ่ม CAs คือ 0.002 และ 0.01 mg/kg พบค่า IC10 มีค่า I(%) 7 9 8 และ 10 ตามลำดับ ความคงตัวของเอนไซม์คาร์บอกซิลเอสเตอร์เรสบริสุทธิ์บางส่วนจากถั่วดำที่เก็บรักษาอุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส นาน 60 วัน พบว่าในระหว่างวันที่ 12-45 ค่า แอคติวิตีจำเพาะเอนไซม์ไม่มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p≥0.05) และมีค่าลดลงร้อยละ 31.7 ในวันสุดท้ายของการเก็บรักษา

การศึกษาเปรียบเทียบความไวของเอนไซม์คาร์บอกซิลเอสเตอร์เรสบริสุทธิ์บางส่วนจากถั่วดำ กับเอนไซม์ของชุดทดสอบทางการค้า พบว่าเมื่อใช้เอนไซม์คาร์บอกซิลเอสเตอร์เรสบริสุทธิ์บางส่วนจากถั่วกับวิธีทดสอบของชุดทดสอบทางการค้า ตรวจวิเคราะห์ยาฆ่าแมลงกลุ่ม OPs และ CAs ในตัวอย่างผักสด จำนวน 50 ตัวอย่าง ซึ่งประกอบไปด้วย แตงกวา ถั่วฝักยาว ใบโหระพา ผักกาดขาว ผักชี ผักชีฝรั่ง กะหล่ำปลี ผักกาดหอม ใบบัวบก และพริกสด พบว่าการทดสอบมีผลการวิเคราะห์สอดคล้องกัน คือ ตรวจไม่พบหรือพบในระดับปลอดภัย จำนวน 46 ตัวอย่าง (ร้อยละ 92) ตรวจพบในระดับไม่ปลอดภัย จำนวน 4 ตัวอย่าง (ร้อยละ 8) โดยจำแนกเป็น ผักชีฝรั่ง จำนวน 3 ตัวอย่าง (ร้อยละ 6) และผักชี จำนวน 1 ตัวอย่าง (ร้อยละ 2) โดยข้อดีของเอนไซม์คาร์บอกซิล เอสเตอร์เรสบริสุทธิ์บางส่วนจากถั่วดำสามารถทำปฏิกิริยาในสภาวะอุณหภูมิห้องได้

การประเมินประสิทธิภาพวิธีการตรวจวิเคราะห์ยาฆ่าแมลงกลุ่ม OPs และ CAs โดยการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์เทียบกับวิธีมาตรฐานที่วิเคราะห์ด้วยเครื่อง GC-FPD+ และ HPLC-FLD ของตัวอย่างผักสด พบว่าวิธีการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ ตรวจพบยาฆ่าแมลงจำนวน 11 ตัวอย่าง (ร้อยละ 22) วิธีมาตรฐานตรวจพบ จำนวน 17 ตัวอย่าง (ร้อยละ 34) ผลการประเมินประสิทธิภาพพบว่าวิธีการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ มีความจำเพาะ (specificity) ร้อยละ 100.0 ความถูกต้อง (accuracy) ร้อยละ 90.0 ซึ่งผ่านเกณฑ์การยอมรับ (ร้อยละ 80–100) ยกเว้นค่าความไว (sensitivity) ซึ่งมีค่าร้อยละ 70.5 เป็นผลมาจากการทดสอบที่ให้ผลลบลวง นอกจากนี้พบ 5 ตัวอย่าง ที่ไม่สอดคล้องกับวิธีมาตรฐาน คือ แตงกวา 1 ตัวอย่าง ผักชี 1 ตัวอย่าง โหระพา 2 ตัวอย่าง และ พริกสด 1 ตัวอย่าง